Summary
Multiple-alvo é um algoritmo de rastreio caseiro desenvolvido para controlar individualmente moléculas marcadas no interior da membrana plasmática de células vivas. Detecção eficaz de, estimar e rastreamento de moléculas ao longo do tempo a alta densidade de fornecer uma ferramenta de fácil utilização, abrangente para investigar a dinâmica da membrana em nanoescala.
Abstract
Nosso objetivo é obter uma descrição detalhada dos processos moleculares que ocorrem em membranas celulares em diferentes funções biológicas. Temos o objetivo de caracterizar a organização complexa e dinâmica da membrana plasmática a nível molécula única, através do desenvolvimento de ferramentas analíticas dedicadas a uma única partícula Tracking (SPT) em alta densidade: Multiple-Target de rastreamento (MTT) 1. Uma única molécula de videomicroscopia, oferecendo milissegundo e nanométrica resolução 1-11, permite uma representação detalhada da organização da membrana 12-14 com precisão o mapeamento descritores, tais como receptores de células de localização, mobilidade confinamento, ou interações.
Nós revisitado SPT, tanto experimentalmente e através de algoritmos. Aspectos experimentais incluíram optimizar a instalação ea marcação celular, com um ênfase particular ao atingir a densidade de rotulagem mais alta possível, a fim de proporcionar um instantâneo dinâmico de um dinâmica moleculars que ocorre no interior da membrana. Questões algorítmicas preocupado cada passo usado para a reconstrução trajetórias: a detecção de picos, a estimativa e religação, dirigida por ferramentas específicas de análise de imagem 15,16. Implementar deflação após a detecção permite picos de resgate inicialmente oculta por vizinhos, os picos mais fortes. De nota, melhorando a detecção impacta diretamente a reconexão, reduzindo as lacunas dentro de trajetórias. Performances foram avaliados através de simulações de Monte Carlo para a densidade de rotulagem e vários valores de ruído, que normalmente representam as duas grandes limitações para medições paralelas na resolução espaço-temporal alta.
A precisão nanométrica 17 obtido para moléculas individuais, utilizando quer sucessiva de ligar / desligar óptica photoswitching ou não-linear, pode fornecer observações exaustivos. Esta é a base de métodos Nanoscopia 17 como STORM 18, PALM 19,20, 21 ou RESOLFT STED 22,23, whiCH podem muitas vezes exigem amostras de imagens fixas. A tarefa central é a detecção e estimativa de difração limitada picos que emanam de um único moléculas. Assim, fornecendo pressupostos adequados, tais como lidar com uma precisão posicional constante em vez do movimento browniano, MTT é diretamente adequado para análises nanoscópicas. Além disso, o MTT pode fundamentalmente ser utilizado em qualquer escala: não só para as moléculas, mas também para células ou animais, por exemplo. Assim, o MTT é um algoritmo de seguimento poderoso que encontra aplicações em escalas moleculares e celulares.
Protocol
Neste vídeo, apresentamos um experimento de acompanhamento integral única partícula, usando-pontos quânticos direcionados para um receptor de membrana específico. O principal objectivo desta experiência consiste em discriminar diferentes tipos de comportamentos difusão molecular medidos no interior da membrana plasmática de células vivas. Com efeito, os movimentos moleculares resultantes na membrana pode desviar-se tipicamente de difusão Browniano sendo linearmente dirigida ou confinada dentro nanodomains 26-29, por exemplo. Temos o objetivo de, simultaneamente, seguindo como muitos receptores como tecnicamente possível, para fornecer um instantâneo da variedade resultante na dinâmica que ocorrem no interior da membrana de uma célula viva. Isto é, em última análise esperado para permitir decifrar dos mecanismos que regulam a sinalização celular dos receptores de superfície.
1. Cultura de Células
- Preparar a amostra celular: usar aderentes células COS-7 que expressam endogenamente o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) 30. Quandotrabalhar com células vivas sem antibióticos certifique-se de não ter nenhuma contaminação sub-detectável latente mediante a utilização de técnicas estéreis em todos os momentos durante a preparação.
- Crescer as células em meio completo (DMEM com 10% de soro de vitela, 1% de glutamina, HEPES 1% e piruvato de sódio 1%, ver tabela de reagentes específicos a seguir), a 37 ° C, com 7% de CO 2, tendo o cuidado de tê-los em sub-confluentes crescimento exponencial, antes de espalhá-las em Lab-Tek.
- No dia antes da experiência, a propagação de 5.000 células / poço em 8-bem câmaras (Lab-Tek) e incubar durante a noite. Contagem de células assegura uma densidade constante de célula, portanto, um rácio reprodutível de Quantum-pontos por célula.
2. Marcação celular
Preparar quantum-pontos com um revestimento específico. Quantum-dots são nanopartículas fluorescentes, composto de semicondutores. Estas nanopartículas são de grande interesse, porque eles são muito brilhantes e fotoestável comparado ao clássicosondas fluorescentes 31,32, o que permite realização de um sinal apropriado para-ruído (SNR) para geração de imagens única molécula.
- Antes do experimento, produzir fragmentos Fab contra EGFR a partir de linha de células de hibridoma (mAb 108, ATCC HB-9764), por digestão com papaína, como descrito anteriormente 21.
- Conjugado Fab com biotina, como por instruções do fabricante (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotinilação Kit; Thermo Scientific, Fig. 1A.).
- Use quantum-dots funcionalizados com estreptavidina (Invitrogen) e emissor de a 605 nm (comprimento de onda de emissão óptimo para a detecção de brilho, e separação de autofluorescência celular).
- Preparar a solução de rotulagem em meio completo (ver tabela de reagentes específicos), a fim de saturar as streptavidins presentes em torno dos pontos de Quantum-, bem como para prevenir a agregação e ligação não específica para as células e para a lamela.
- Prepare duas soluções intermediárias:um com quantum-dots-estreptavidina e outro com Fab biotinilado, cada uma a 20 nM.
- Misturar um volume igual de estas duas soluções: misturar os pontos quantum-com Fab na relação de 1:1 para se obter uma concentração final de trabalho de 10 nM Fab: Quantum-pontos complexos. Usando uma proporção equimolar favorece a formação de mono-funcionalizados complexos compostos de um quantum-ponto e um fragmento Fab biotinilado. Isto favorece a rotulagem monovalente, limitando observações artefacto, devido à ligação cruzada do receptor 33,34.
- Incubar durante 15 minutos a 25 ° C, utilizando um agitador a 1.200 rotações por minuto para evitar a agregação. A mistura é então pronto para usar em células vivas.
- Incubar as células em 100 uL de mistura durante 5 minutos a 37 ° C, com 7% de CO2.
- Lave as células com os não-autofluorescente meio de imagem (HBSS tampão, HEPES 1%, ver tabela de reagentes específicos) pré-aquecida a 37 ° C.
- Cuidadosamente remover o excesso de rótulos para evitar unnecessário estragar o SNR por não acoplado, fora do foco quantum-pontos, por lavagem extensivamente cada poço com imagem latente médio, normalmente de 5 vezes à temperatura ambiente, com pelo menos 5 minutos atraso antes da última lavagem.
3. Configuração óptica
A configuração de vídeo-microscopia é composto de quatro partes principais:
- Um microscópio invertido com um cubo específico de fluorescência (excitação FF01-457/50, FF495-DI02 dicróico, e FF01-617/73 filtros de emissão, Semrock) e uma alta abertura numérica (1,3 ou 1,49) óleo de imersão-100x objectivo.
- Uma lâmpada de mercúrio de 100 W (acoplado ao microscópio através de uma fibra óptica, evitando a interferir com a termorregulação).
- Um 512 x 512 pixels sensibilidade elevada EMCCD câmara para atingir um SNR suficiente.
- De uma incubadora para manter as amostras biológicas, a 37 ° C durante a experiência.
4. Aquisição
- Selecione as células isoladas e bem-propagação. Estefavorece a extensão da lamellipodia, belo apartamento, melhor adaptada a olhar para o movimento planar das moléculas da membrana.
- Avaliar o estado fisiológico celular por sua aparência, tanto na luz transmitida e da fluorescência: tráfego vesicular intenso, ausência de sinais de necrose ou apoptose e autofluorescência baixa e média-forte de rotulagem quantum-dot (normalmente até 1.000 Quantum-pontos por célula, consulte Fig. 1B, C).
- Selecione uma densidade de rotulagem elevado, o que é fundamental para monitorar simultaneamente receptores tantas quanto possível. Esta é realmente limitado, tanto pela fisiológico (expressão de superfície, a acessibilidade epítopo, o movimento lateral) e os parâmetros de algoritmos (não sobrepostos ponto propagação da funções (PSF), mesmo tendo em conta a desfocagem devido ao movimento, para permitir a detecção adequada e reconexão).
- Para cada célula, em primeiro lugar adquirir uma imagem de campo de campo claro (de preferência utilizando DIC, se disponível), que pode ainda permitir a verificação para o aspecto de célulase os limites espaciais do lamellipodia.
- Salve esta imagem com o mesmo nome do vídeo-stack (como cell1.tif & cell1.stk por exemplo), em uma sub-pasta chamada dic, uma vez que, com essas convenções, o algoritmo pode encontrar automaticamente para trás a imagem correspondente para cada pilha.
- Adquirir 1 a 3 vídeos por celular, de forma contínua, normalmente em 36-ms taxa, a taxa mais rápida possível em full frame com esta câmara. No entanto pode-se adquirir em freqüências mais altas, até 1-ms taxa, usando CCD dedicado com maior sensibilidade e / ou menos pixels. A tecnologia de transferência de quadro fornece atraso insignificante entre os quadros.
- Electron melhoria multiplicam deve ser sempre ajustado no máximo (abaixo de saturação, se for o caso) para permitir atingir a sensibilidade única molécula, com um SNR suficiente, pelo menos acima de 20 dB (para detecção de pico eficiente 1), normalmente em torno de 25-30 dB.
- Normalmente, adquirir 300 quadros por pecado de vídeo,ce trajetórias são reconstruídos sobre ~ 100 quadros, em média, em sua maioria limitados por longas eventos que piscam. Frequência de vídeo e de comprimento pode ser adaptado para uma determinada medida, o que poderia exigir vestígios mais longos, por exemplo.
5. Análise de MTT
- Selecione o caminho para o diretório contendo os arquivos de vídeo para avaliar um conjunto de dados fornecido com Matlab ou Octave.
- Para iniciar a análise totalmente automatizado 1,35, digite o comando detect_reconnex23 em Octave, ou MTT23i em Matlab. Este programa representa a "versão 2.3, com interface de usuário" e está disponível para download, juntamente com a versão anterior 2.2. É primeiro exibe uma interface gráfica listar todos os parâmetros utilizados, como mostrado na fig. 2.
6. Os resultados representativos
MTT analisa automaticamente cada gravador de vídeo, para entregar os traços de alvos detectados e estimados, complementadas por outros emInvestigações, tais como detecção de confinamento. Esta última análise, permite que vestígios de mapeamento sobre as imagens de células (Fig. 1C e 3).
Descrição MTT
A análise de MTT núcleo é executada através de cada quadro, invocando 3 tarefas principal (Fig. 3):
- Detecção da presença ou ausência de um alvo (quantum-ponto), dentro de uma sub-região de deslizamento sucessivamente centrada em torno de cada pixel, onde duas hipóteses são comparados: presença quer de um sinal, com o PSF modelized como um bi-dimensional Gaussian pico , ou apenas o ruído, utilizando um limiar de alarme segurar o suficiente baixa falso, com menos de uma detecção espúrio por quadro. Isto leva a um mapa de probabilidade de detecção. Cada máximo local é considerado como um alvo putativo, assegurando que o seu nível de probabilidade é maior do que um valor mínimo, definido de acordo com a probabilidade desejada de falso alarme (PFA). Esse limite é definido baixa o suficiente para discriminar com eficiência signais de ruído, evitando, na melhor das detecções falsas (PFA de 10 -6 por padrão, para garantir a menos de um erro em 512 x 512 pixel imagens), permitindo ainda uma probabilidade suficientemente elevada de detecção, atingindo o 1 previsto teoricamente ideal. Note-se que a necessidade de usar uma sub-região implica que as fronteiras de imagem (3 pixels, para uma janela padrão de 7 x 7 pixels) não pode ser avaliada.
- Estimativa, para cada alvo detectado, dos parâmetros relevantes, tais como sub-pixel de posição e intensidade do sinal. Para cada alvo detectado, pelo menos um-quadrado ajuste de Gauss-Newton é em seguida realizada para estimar a posição, largura e altura do Gaussian detectado. Isto proporciona nomeadamente a posição de subpixel do corante (10 a 20 nm para exatidão valores típicos da SNR e corantes imóvel ou lentamente difusão, aumentando até ~ 100 nm para corantes difusão a 0,1 uM 2 / s).
- Reconexão das novas metas com otraços já construiu ao longo dos quadros anteriores. O conjunto de novas metas é combinado com o conjunto de traços anteriores. Para este efeito, a fim de atribuir a cada alvo a um traço, se possível, todas as informações disponíveis estatístico obtido a partir do passo de detecção é usado, não só a posição, mas também a intensidade, a largura de piscar e estatísticas associadas. Assim, as metas não são designadas para o próximo traço: em caso de vestígios de passagem, intensidade, velocidade, largura e piscando será considerada. Isto proporciona a pontuação reconexão estatisticamente ideal. Essa estratégia evita, quando possível, a polarização do reconexão em direção aos vizinhos mais próximos.
Picos detectados pode ser rejeitado se a posteriori a sua estimativa ou reconexão falha. Um teste especial trata a detecção de novos picos, o que poderia iniciar vestígios novos. Este teste utiliza um PFA mais rigoroso (10 -7), uma vez que voltar a ligar um pico a um traço pode ser interpretada de facto como um ó validação f sua relevância (este critério ser, por definição, não é aplicável para novos picos).
Análise da trajetória
Confinamento transiente possível é em seguida avaliada por uma função inversamente relacionada com a difusão local 24-29. Aplicando um limiar permite definir confinado ou não episódios. Iterando sobre todos os vestígios destes, podemos mapear a dinâmica da membrana, em termos de confinamento transitória / desacelerar eventos. Isto pode ser alternativamente representado usando o binário ou valores discretos da presente índice confinamento.
Por padrão, o MTT executa automaticamente as tarefas, economizando 8 parâmetros de pico em um arquivo de texto: número de quadro, i e j posição, intensidade de sinal, raio, offset e piscar, para cada quadro do vídeo (grupo de 7 linhas) e trace (coluna) . Estes parâmetros de saída pode ser recarregado em Matlab ou Octave usando o script fread_data_spt para continuar a analisar os vestígios ou seja, ou de intensidade de sinal, como exemplificado na "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example roteiro em anexo.
Outras análises levar a mapear vestígios sobre cada célula (Fig. 1C e 3) e para proporcionar uma distribuição do histograma para os parâmetros relevantes (tais como as intensidades de pico, ou valores SNR de difusão locais). Para cada arquivo, média e desvio padrão de cada parâmetro são salvos em um arquivo de texto, juntamente com uma imagem dos histogramas. Distribuições logarítmicas, tais como, por deslocamentos quadrados r 2, levar a média geométrica. O coeficiente de difusão D é calculado a partir de um ajuste linear ao longo dos cinco primeiros pontos da curva de MSD. Esses valores fornecem uma visão geral de um experimento envolvendo a cinética exemplo de reações celulares ou tratamentos farmacêuticos / enzimática que afetam a organização da membrana. Uma vez que MTT é um código de fonte aberta, este aspecto pode ser prontamente adaptado para qualquer investigação dedicado.
599fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/>
Figura 1. Monitorização dinâmica receptores de membrana por MTT. Componentes (a) a membrana, tais como o EGFR, são marcados com quânticos-pontos acoplados a fragmentos Fab biotinilado (desenho esquemático com raspagem aproximadamente correcta de cada molécula). (B) da imagem fluorescente típica adquirido a partir de um vivo COS-7 de células, com 36-ms de tempo de exposição, que descreve difracção limitada picos correspondentes ao receptor individualmente rotulado. (C) de saída da análise de MTT exibindo as trajectórias reconstituídos dos receptores, cobrindo a imagem de campo claro da célula.
Figura 2. Parâmetros de entrada MTT. Correndo MTT23i abre uma interface gráfica de usuário listando todos os parâmetros de entrada, nomes e valores padrão, como descrito em nossa publicação anterior 1. Nos parâmetros espaciais algoritmo, eo tempo (janelas de pesquisa, o raio de pico, a difusão máxima e piscando) são adimensionais em unidades padrão, pixels e quadros. Calibrações pode ser aplicado a posteriori para converter resultados de saída. Os valores padrão, correspondente a um 512BFT Cascade com ampliação de 100x, são o tamanho do pixel: 156 nm / pxl e atraso quadro: 36 ms / frame.
Os investigadores devem otimizar alguns parâmetros críticos, tais como o coeficiente de difusão máxima esperada ("Diff max") e desaparecimento de piscar máximo ("T off"). Estes dois limites de espaço e tempo são quase os únicos que precisam de ser reexaminadas para uma determinada condição experimental, sendo os outros definidas para valores padrão robustos. Por exemplo, o número de falsos alarmes está directamente definido para garantir menos de um erro por milhão de pixels, por conseguinte, menos do que um por quadro, o que é satisfatório na maioria dos casos. Todos os parâmetros são salvos em um arquivo de texto na pasta de saída, permitindo que os usuários verifiquem posteriormente as configurações que foram usadas para análise.
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Figura 3 "/>
Figura 3. Principais passos de a análise de MTT. Partindo de uma pilha experimental de imagens de fluorescência, os picos são sequencialmente e automaticamente detectado, estimada por um ajuste de Gauss e religado ao longo quadros (primeira gama de operações, parte superior do fluxograma). Traços pode ainda ser analisado para o confinamento putativo, por exemplo, em última análise, levando a um mapa dinâmico de descritores relevantes (segunda gama de operações, parte inferior).
Figura 4. Valência rotulagem não tem impacto sobre MTT. Para avaliar o possível viés introduzido pela rotulagem multivalente artefactual, análise de MTT foi realizado para rastrear EGFR endógeno marcado com 2 esquemas diferentes, para gerar e analisar mapas de trajetórias. (A) receptores foram marcados com Fab biotinilado e quantum-dots605-estreptavidina, como descrito no protocolo.Neste caso, a valência de multi-quantum-pontos e streptavidins pode resultar em vários receptores de acoplamento a um corante único. (B) receptores foram marcados com Fab directamente acoplado a um corante orgânico, Atto647N. Neste caso, um Fab, portanto, um receptor, pode ser acoplado a mais do que um corante. (C) A média de deslocamento da curva quadrada (MSD) foi calculada para todos os traços de cada célula, rotulado ou com quantum-dot ou corantes ATTO (gráficos esquerda e direita, respectivamente). Coeficientes de difusão foram computados por ajuste linear ao longo dos cinco primeiros pontos da MSD (linha vermelha pontilhada). Cada esquema de marcação levou a valores de difusão semelhantes (gráfico central). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 células), Atto: Atto647N (n = 7 células), ns: não significativo (teste t de Student valor p> 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Em uma única partícula de rastreamento, ao lado dos aspectos de células e microscopia, a análise representa uma parte substancial do trabalho. Isso resolve o algoritmo usado para executar as três tarefas principais: detectar, estimando-se e reconectando picos em cada frame. Mas o aspecto conseqüente deste trabalho reside na elaboração do algoritmo em si, que podem precisar ser adaptado para qualquer nova investigação dedicada, essencialmente, para os últimos, os passos extras (como decifrar os modos de movimentos, interações ou estequiometria).
No entanto, uma vez que o algoritmo é totalmente desenvolvida, correndo é simples, especialmente uma vez que atenção a manter o número de parâmetros de entrada, no mínimo (Fig. 3). Isso torna MTT muito robusto e fácil de implementar. Ao elaborar MTT, objetivou-se inteiramente reconsiderar as opções de análise utilizados para cada tarefa. Queríamos otimizar o processo ao longo de dois eixos desafiadoras:
- Lidar sagacidadedensidades h elevados de rotulagem fornece informação espacial detalhada em termos de amostragem de superfície celular. Idealmente, um tentaria seguir uma população quase completa molecular simultaneamente, a fim de obter uma observação integral. No entanto, a rotulagem exaustiva tal conduziria a uma imagem semelhante ao que classicamente obtido por imunofluorescência, sem uma única molécula de resolução, uma vez que todas as etiquetas fortemente sobrepõem devido a difracção. Para obter o número molecular típica (ou seja 5 ~ 10 receptores por célula 30) e tamanho da célula (ou seja, ~ 30 mm), se assumirmos uma distribuição homogênea, a distância molécula inter-média é de ~ 100 nm. Difusão durante a aquisição também contribui para a propagação do PSF numa proporção comparável: tipicamente ~ 100 nm para o movimento browniano em 0,1 mM 2 / s durante 30 ms. Convém sublinhar que esta se espalhando é isotrópico em média e, portanto, ainda gera uma PSF gaussiana-like. Daí até 10% da população pode ser detectado teoricamente, uma vez que isso iria lead para uma distância média de ~ 300 nm, compatíveis com os limites de difracção e de movimento. No entanto, este tem de ser modulada por contabilização de falta de homogeneidade na distribuição espacial, a rotulagem limitações (tais como restrições de natureza espacial, a acessibilidade de epítopo, etc), aumentando e até mesmo os conflitos insolúveis devido a percursos de passagem, e eficiência de detecção geral. Experimentalmente, podemos chegar e precisa monitorar uma fração substancial da população geral, com densidades de ~ 1000 rótulos dentro de um campo de visão de 80 mM largura. Este limite superior resultados a partir de um compromisso entre a necessidade de detecções individuais eo objectivo de uma medição exaustiva espacial (ver fig. 1C para apreciar a amostragem espacial da superfície da célula).
- Manusear o SNR mais fraco possível permite imagens quer a iluminação baixa, o que é benéfico para as células de viabilidade, e / ou a alta velocidade, que fornece informação melhor temporal. No entanto, isto implica sinais inferiorespor imagem, devido ao menor número de fótons coletados. Note-se que o menor tempo possível por câmaras EMCCD (1 ms) parece corresponder a mais baixa SNR aceitável (20 dB) para detecção apropriada e estimação por MTT.
Marcando valência é um tema recorrente em estudos de moléculas individuais. Na verdade, a medida direta da razão corante / target é altamente desafiador 34. No entanto, um caminho alternativo para investigar o suposto viés introduzido pela rotulagem multivalente artefactual consiste em comparar as medidas, quer com quantum-dot tags (com metas supostamente por vários corante, induzindo reticulação artefactual) ou orgânicos etiquetas corante (com, no contrário, corantes supostamente várias por alvo, polarização de intensidade de sinal apenas e branqueamento características). Nós e outros 6,36,37 ter observado um comportamento comparável quando usando quer quantum-pontos ou corantes orgânicos (atto647N no nosso caso, a fig. 4), em termos de difusão e de transição entre modes do movimento. Variação em valores de difusão entre as duas condições é menor do que a disparidade célula-célula (Fig. 4C). Isso mostra que a valência rotulagem, mesmo se não for estritamente monovalente, não afeta significativamente os resultados do SPT.
Confinamento e interações moleculares
Confinamento transitória ou estável pode ser interpretado como a assinatura de afinidade preferencial ou interação 24-29. Biomembranas são de fato altamente heterogênea, com assembléias locais ditadas por características estruturais, tais como hidrofobicidade, tamanho transmembrana e tensão interfacial. Estas forças motrizes levar a remodelação espaço-temporal dos conjuntos funcionais com funções críticas para ou seja, sinalização, adesão ou tráfico. Mapeamento e quantificação de tais eventos é esperado para fornecer uma chave para decifrar como uma célula integra estímulos continuamente apresentados. Na verdade, para uma célula, exibindo uma adaptação adequada através de um req resposta precisauires ajustar as interações entre os parceiros de sinalização e seu ambiente. Receptores de membrana podem interagir tanto com o citoesqueleto da membrana sub-grades, estruturas de membrana, tais como poços de endocitose ou adesões focais, ou também parceiros protéicos / lipídico, envolvidas na sinalização domínios, por exemplo. Em nossa representação, tais eventos podem ser investigados através da força de confinamento e suas variações no espaço e no tempo. Isso reforça a importância de trabalhar em maior resolução espaço-tempo possível, tendo em conta os constrangimentos associados a tempos curtos e elevadas densidades, como discutido acima.
Técnicas Complementares
É uma boa prática para comparar essas medições dinâmicas com outras abordagens. Por exemplo outras técnicas de microscopia dinâmicas, como FRAP e FCS, fornecem uma sensibilidade complementar e resolução 4,38,39. FRAP fornece um conjunto de medição difusão molecular, enquanto FCS pode atingir single molécula de sensibilidade, com uma resolução muito boa. No entanto, ambos os métodos são inerentemente limitada a uma medida local (tipicamente dentro de uma mancha confocal). Isso motivou-nos a aproveitar e empurrar os limites das possibilidades espaciais da SPT:. Investigando um grande campo de visão, para abranger uma célula inteira de uma só vez, juntamente com uma precisão localmente relevante espaço-temporal
Novos desenvolvimentos e investigações
De acordo com a gama de perguntas biológicas que podem ser tratadas usando molécula única medições, MTT pode ser estendido ao longo de várias direcções, em cada nível: detecção, a estimativa de religação, e análises posteriores. Por exemplo, pode-se considerar lidar com mais do que uma população molecular, chamando para a detecção multicolor - como pode ser realizada utilizando dedicados regimes óptica ou analítica. Estimativa pode incluir novos descritores relevantes, tais como qualquer informação espectral ou polarização, ou a axiaisz posição, para estender o rastreamento em 3D 40.
Para reconexão, os pressupostos browniano e pisca-pisca pode ser totalmente repensada para um problema específico. Curiosamente, molécula única medições foram prorrogadas na última década para o chamado regime nanoscópico 17,22,23. Embora MTT está directamente endereçamento única molécula de localização, que é de importância crucial para considerar o caso de uma amostra fixa, que fornece uma solução segura para uma localização exaustiva de uma população molecular. No entanto, em tal caso, a suposição Browniano já não é válida. Substituí-lo com precisão lidar com uma medida nanoscópico, limitado apenas pela SNR, é fundamental para alcançar a melhor resolução nanométrica.
Ao longo desses desenvolvimentos, com base em um ou multicolor, 3D e / ou medidas exaustivas, o trabalho futuro é esperado para entregar uma visão abrangente dos moleculares dados estáticos e dinâmicos. Isto terá um relev diretodade para estudos de biologia celular, tais como decifrar as modalidades sutis que regulam a sinalização extra e intracelulares.
Baixando MTT
O código fonte do MTT está disponível como software open-source para a pesquisa acadêmica. Ele pode ser baixado da nossa página web, em ciml.univ-mrs.fr , ao navegar para página de nossa equipe, Ele & Marguet Lab, que fornece um link para a descrição do software e download. Por favor note que nós solicitamos seu nome e instituição apenas para informação, por exemplo, no caso de colaboração mais ou para informá-lo sobre uma nova versão ou atualização.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos os membros da nossa equipe, especialmente Blache MC para assistência técnica, bem como M e Irla B Imhof, pelo apoio e discussões proveitosas. Figuras de deflação e confinamento reproduzida cortesia do Nature Methods. Este projecto é apoiado por verbas institucionais do CNRS, Inserm e Marselha Universidade, e por concessões específicas da Região Provence-Alpes-Côte d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 Blan 1214 01) e Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR é apoiado por uma bolsa de estudos do Nationale Contre le Cancer Ligue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M.
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M.
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J.
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C.
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
