Las células cultivadas del músculo son un modelo inadecuado para recapitular músculo inervado En vivo. Una unidad motora funcional puede ser reproducida In vitro Por la inervación de las células humanas diferenciadas musculares primarias, utilizando explantes de embriones de rata de la médula espinal. En este artículo se describe cómo co-cultivos de explantes de la médula espinal y las células musculares se han establecido.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Una unidad motora funcional en la placa de cultivo: Co-cultivo de explantes de la médula espinal y las células musculares
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células musculares primarias cultivaron en monocapa aneurally raramente contraen espontáneamente porque, en ausencia de un componente de nervio, la diferenciación celular y el motor se limita la estimulación de neuronas que falta 1. Estas limitaciones dificultan el estudio in vitro en el de muchas enfermedades neuromusculares en las células musculares cultivadas. Es importante destacar que las limitaciones experimentales de células monocapa, músculo cultivadas pueden ser superados por la inervación funcional de miofibras con explantes de médula espinal en co-cultivos.
Aquí, se muestran los diferentes pasos necesarios para lograr una inervación eficiente, adecuada de las células musculares primarios, que conduce a completar la diferenciación y la contracción de fibra de acuerdo con el método desarrollado por Askanas 2. Para ello, las células musculares son co-cultivadas con explantes de la médula espinal de embriones de rata en el ED 13,5, con los ganglios de la raíz dorsal todavía unido a las rebanadas de la médula espinal. Después de unos días, el músculo fibros comenzará a contraerse y, eventualmente, convertirse en la cruz-estriado a través de inervación por neuritas funcionales que se proyectan desde los explantes de la médula espinal que se conectan a las células musculares. Esta estructura puede mantenerse durante muchos meses, simplemente por intercambio regular del medio de cultivo.
Las aplicaciones de esta herramienta de valor incalculable son numerosas, ya que representa un modelo funcional para realizar análisis multidisciplinarios de desarrollo de los músculos humanos y la inervación. De hecho, una completa instalación de novo unión neuromuscular se produce en un plato de cultivo, permitiendo una fácil medición de muchos parámetros en cada paso, en un contexto fundamental y fisiológicas.
Sólo para citar algunos ejemplos, genómica y / o estudios de proteómica se puede realizar directamente en la co-culturas. Además, los efectos de pre y post-sináptica puede ser específica y se evaluó por separado en la unión neuromuscular, debido a que ambos componentes provienen de diferentes especies,rata y humano, respectivamente. El nervio-músculo co-cultivo también puede realizarse con células musculares humanas aisladas de pacientes que sufren de enfermedades neuromusculares músculo o 3, y por lo tanto puede ser utilizado como una herramienta de detección para los fármacos candidatos. Finalmente, ningún equipo especial, pero una instalación normal BSL2 se necesita para reproducir una unidad de motor funcional en una placa de cultivo. Este método, por lo que es valioso tanto para el músculo, así como las comunidades de investigación neuromusculares para estudios fisiológicos y mecanicista de la función neuromuscular, en un contexto normal y la enfermedad.
Protocolo
1. Preparación de la primaria la cultura humana de la célula muscular
- Establecer los cultivos de músculo de células humanas de acuerdo con la técnica de re-explantación-4 explantación. En primer lugar, eliminar los no-tejido muscular de las biopsias. A continuación, incorporar 1 mm 3 explantes de músculo en un coágulo de plasma, lo que permite salir de los fibroblastos para los explantes.
- Los explantes incrustadas se transfieren a un plato recubierto de plasma gelatina y dejarlas crecer en medio de crecimiento normal (MEM suplementado con 25% medio 199, 10% de suero fetal bovino [FBS], 1% de penicilina / estreptomicina, 10 mg / ml de insulina, 10 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico humano [EGF], 12,5 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos humanos [FGF]) en una monocapa. Las células que surgen de los explantes bajo esas condiciones son las células musculares. Estas células continuará creciendo en una monocapa después de la eliminación de los explantes.
- Cultivar las células aneurally en gelatina al 0,1% recubiertos con placas en medio de crecimiento normal. Las células pueden seraneurally cultivaron y se amplifica cuando sea necesario. Es mejor utilizar células del músculo en un paso entre 3 y 8 para realizar los co-cultivos. Es de suma importancia para inervar miotubos jóvenes, después de este punto, los co-cultivos tienen un alto riesgo de fracasar. Además, miotubos no debe ser demasiado grande y demasiado grueso.
- Dos días antes de la inervación está previsto, la placa de las células musculares en placas de 35 mm de cultivo de tejidos (o placas de 6 pocillos) a una densidad de 500.000 células por placa en medio de crecimiento normal. En ese densidad, las células están en la confluencia adecuado para iniciar la fusión en el día siguiente, y la inervación posterior del día después. Utilizando esas condiciones, los miotubos se encuentran en la etapa correcta de la inervación y la contracción de la fibra óptima, por tanto posterior.
- Al día siguiente, reemplazar el medio de crecimiento normal con un medio de fusión compuesta de MEM suplementado con 25% medio 199, 5% de FBS, insulina 10 ug / ml y 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Isolati el de la rata explantes embrionarias de la médula espinal
Todo el procedimiento para aislar los explantes de médula espinal se realiza bajo un microscopio binocular, en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) que contiene 10% suero bovino fetal (FBS).
- Es crucial que los embriones de rata se encuentran entre 13 y 14 de la disfunción eréctil como una etapa de desarrollo diferente pondría en peligro todo el procedimiento. El sacrificio de una mujer embarazada de CO 2 y recoger toda la cadena de embriones en un medio de HBSS. Aislar cada embrión y decapitar a favor de la eutanasia.
- Disecar el cordón espinal de embriones desde el resto del cuerpo de una sola pieza y quitar músculo que rodea y tejido conectivo. Tenga mucho cuidado de mantener los ganglios de raíz dorsal (GRD) conectados a la médula espinal para garantizar la inervación funcional.
- Corte cada médula espinal transversalmente de manera que cada explante contiene al menos 2 DRG unido a él (explantes de 1 mm 3).
- Eliminar el medio de fusión en el cultivo de células del músculo, dejando una fina capa de medio sobre la monocapa.
- Coloque los explantes con cuidado en la capa de células musculares, cinco explantes uniformemente espaciados por placa de 35 mm.
- Añadir muy lentamente, gota a medio sabio, la fusión en cada explante. Es necesario añadir medio para las células musculares para sobrevivir, pero no demasiado para permitir que los explantes de adherirse primero y hacer contacto con las células. Si el medio no se agrega correctamente (demasiado fuerte o demasiado medio), los explantes se flotará y no podrá inervan las células musculares.
- Una vez que los explantes de empezar a cumplir, arriba del medio de la fusión de 2 ml por placa de 35 mm, y poner los platos con mucho cuidado de nuevo en la incubadora.
4. El mantenimiento de los heterólogos nervio-músculo Co-culturas
- Cambiar el medio de la fusión dos veces por semana.
Tan pronto como dos días después de la inervación, es posible ver las neuritas que salen de cada explante y establecer contactos con las células musculares, representadas por las estructuras como botón-(Fig. 1).
Ya en 4-6 días después de la inervación, unos pocos fibras individuales comenzará a contraerse.
Las contracciones persistir durante muchos meses, mantiene simplemente cambiando el medio de cultivo dos veces a la semana.
Después de aproximadamente 2 semanas, el explante de la médula espinal se degenera, pero la inervación se conserva. Esto es normal. Una fina capa de componente nervio queda en la superficie de la capa de células del músculo. Esta red nervioso es suficiente para mantener la funcionalidad de la unidad de motor.
Si los explantes flotar en el medio el día después de inervación, nunca se adherirá. Esto ocurre cuando la capa de células del músculo esno suficientemente confluente, o cuando el medio se añade demasiado áspero. A veces, los explantes se adhiere, pero no saldrá neuritas. Esto es probablemente debido a la falta de DRG adjunto a la misma. En este caso también, la inervación no se establecerá. Manipular los platos con mucho cuidado la primera semana, ya que los explantes todavía se puede separar fácilmente. Para intercambiar los medios de fusión, añadir el líquido gota a gota con una velocidad mínima para evitar el desprendimiento de células.
Figura 1. De la médula espinal, las células musculares explantes co-cultivos a partir del día 1 al día 15.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Una herramienta fisiológica in vitro para estudiar la función de las células musculares en el contexto normal y lo patológico es de mayor interés para los myologists, debido a cultivos de células musculares no suelen recapitular la importancia de las células y las conexiones múltiples de tipo celular. La adición de las neuronas motoras purificadas a las células musculares no es suficiente para lograr una unidad de motor funcional ya que la presencia de células de Schwann se requiere para la inervación para ser ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Nuestro trabajo es apoyado por la Swiss National Science Foundation (SNF), la Iniciativa de Suiza en Biología de Sistemas (SystemsX.ch), la Asociación de Distrofia Muscular EE.UU. (MDA), la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM), la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF), la Fundación Gebert-Ruf Enfermedades Raras Programa (GRF), la Sociedad Suiza para la Investigación de las Enfermedades Musculares (SSEM / FSRMM), el Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Medizinische Forschung und Volksgesundheit", la Roche Fundación para la Investigación y la Universidad de Basilea.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| HBSS | Gibco / Invitrogen | 14170 | |
| MEM | Gibco / Invitrogen | 31095 | |
| Medio 199 | Gibco / Invitrogen | 31153 | |
| Suero Bovino Fetal | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| La insulina | Sigma | I9278 | |
| EGF humano | Sigma | E9644 | |
| Humanos FGF | SiGMA | F0291 | |
| La penicilina / estreptomicina solución | Gibco | 15140 |
Referencias
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
