Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal: Ex vivo RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino

Resumen

Para llevar a cabo una evaluación rápida de la función de los genes en el desarrollo de la corteza cerebral, se describen procedimientos que implican la Ex vivo de plásmidos co-expresión de inhibitoria ARN (RNAi), y las buenas prácticas agrarias en la corteza de embriones de ratón. Este protocolo se presta al estudio de diversos aspectos de neurodesarrollo, tales como la neurogénesis, la migración neuronal y la morfogénesis neuronal incluida la dendrita y axón.

Resumen

La corteza cerebral dirige las funciones cognitivas superiores. Esta estructura seis capas se genera en el interior de un primer, fuera-última forma, en el que las neuronas primeros nacidos permanecen más cerca al ventrículo, mientras que las neuronas últimos nacidos migran más allá de las neuronas primeros nacidos hacia la superficie del cerebro ^1. Además de la migración neuronal ^2, un proceso clave para la función cortical normal es la regulación de la morfogénesis neuronal ^3. Si bien la morfogénesis neuronal puede ser estudiado in vitro en cultivos primarios, hay mucho que aprender de cómo estos procesos están regulados en los entornos de tejidos.

Se describen las técnicas para analizar la migración neuronal y / o la morfogénesis en rodajas organotípicos de la corteza cerebral ^4,6. Un vector pSilencer modificado se usa que contiene tanto un promotor U6 que impulsa el ARN de doble hebra de horquilla y un casete de expresión independiente que codifica la proteína GFP impulsado bya promotor CMV ^7-9. Nuestro enfoque permite la evaluación rápida de los defectos en el crecimiento de las neuritas en caída específica de genes candidatos y ha sido utilizado con éxito en una pantalla para que los reguladores de crecimiento de las neuritas ^8. Debido a que sólo un subconjunto de células se expresan las construcciones RNAi, las rebanadas organotípicos permitir un análisis del mosaico de los fenotipos posibles. Además, debido a este análisis se realiza en una aproximación cercana del entorno in vivo, que proporciona un bajo coste y rápida alternativa para la generación de animales transgénicos o knockout para los genes de función desconocida cortical. Finalmente, en comparación con la tecnología de electroporación in vivo, el éxito de los ex experimentos in vivo electroporación no depende de desarrollo proficiente habilidad cirugía y se puede realizar con un tiempo de formación más cortos y habilidad.

Protocolo

1. Preparación de Soluciones de Cultura y Medios de Comunicación (no en el vídeo)

1. Preparar 1 litro de solución salina equilibrada completa de Hank (HBSS) que contiene HBSS 1x, 2.5 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM de D-glucosa, 1 mM CaCl _2, 1 mM de MgSO ₄ y 4 mM NaHCO _3. Agregue el agua doblemente destilada (DDC ₂ O). Filtrar con un filtro de esterilización de 0,2 micras y se almacena a 4 º C.
2. Para preparar el medio de cultivo utilizando rebanada 35 ml de Medio Basal de Eagle medios, 12,9 ml de HBSS completos, 20 mM de D-glucosa (1,35 ml de solución 1 M), 1 mM de Glutamax (0,25 ml de una solución 200 mM), 0,5 ml de penicilina -estreptomicina 100x de valores. Filtrar esterilizar con un filtro de 0,2-m, a continuación, añadir inactivado por calor suero de caballo a una concentración final de 5%.
3. Preparar una solución laminina de trabajo, haciendo un 1 mg / ml de solución madre laminina con agua desionizada estéril destilada. Preparar 100 ml de alícuotas de 0,5 ml tubos Eppendorf y se congela a -80 ° C.
4. Preparar poli-L-lisina de trabajo paralución mediante la adición de 5 ml de H ₂ O estéril a 5 mg de poli-L-lisina para hacer un 1 mg / ml de solución de stock. Preparar alícuotas de 1 ml y congelar a -20 ° C.
5. Preparar una solución de revestimiento mediante la dilución de 1 ml de poli-L-lisina y 100 l de laminina a un volumen final de 12 ml con agua estéril. Haga esta solución fresca cada vez.

2. Preparación Inserta organotípicos Slice (no en video)

1. Prepare dos seis placas con inserción de la cultura y uno por el uso de fórceps estériles. Añadir 2 ml de agua estéril O ddH ₂ por debajo de las inserciones de la cultura.
2. Añadir 1 ml de la solución de revestimiento en la parte superior de la membrana teniendo cuidado de no perforar la membrana. Incubar toda la noche en un incubador humidificado a 37 º C y 5% de CO _2.
3. Extraiga el material de recubrimiento y lavar la membrana con estériles de H ₂ 0 tres veces. Que insertos en seco antes de usarlo. Añadir 1,8 ml de medio de corte cultura y el lugar en el 37 ° C incubadora. Envuelva las placas utilizadas con Parafilmy se almacena a 4 º C durante un máximo de 4 semanas.

3. Preparación para la electroporación (no en el vídeo)

1. Preparar las construcciones de RNAi para la electroporación. Doble hebra insertos horquilla de ARN fueron clonados en un vector pSilencer. Los plásmidos Contiene: 1) un promotor U6 que impulsa la doble cadena de generación de ARN, y 2) un casete de expresión GFP dirigido por el promotor CMV ^8,9. Este plásmido ha sido descrito previamente por Konishi y colegas ⁹ y otros ^7,8. Los plásmidos se purificaron utilizando un Qiagen maxi-prep kit, y se utiliza a una concentración de 1 mg / ml.
2. Con el fin de visualizar ADN, mientras que la inyección, preparar una solución al 0,5% rápido colorante verde y utilizarlo a las 1:20 con el ADN que se inyecta (normalmente 20 l de ADN con 1 l de verde rápido). Quede sobre ADN-rápido mezcla de colorantes verde puede ser almacenada a -20 ° C durante hasta una semana.
3. Área de disección limpia, dissectiherramientas ng y vasos vibrátomo con etanol al 70%. Enfriar HBSS completas de modo que sea frío hielo. Chill vibrátomo nave de embalaje de hielo a su alrededor en el interior del vibrátomo con un poco de agua para el enfriamiento rápido. Preparar un 3% bajo punto de fusión de agarosa utilizando HBSS completos. Microondas durante 1 minuto. Evitar el exceso de ebullición. Mantener en un baño de agua a 42 ° C hasta su uso.
4. Electroporación parámetros se fijan de la siguiente manera. Para un uso de embriones E15 35 V, 5 pulsos de longitud, 100 m, 900 m de intervalo entre los pulsos. Para los animales mayores, para asegurar la electroporación, utilizar un voltaje más alto hasta 50 V o aumentar el número de pulsos de hasta 8 pulsos. Para evitar dañar el tejido en animales jóvenes, utilizar impulsos ya sea menos o pulsos de hasta un 2 y un menor voltaje de hasta 25 V. Estos parámetros pueden variar y determinar empíricamente dependiendo de la edad del animal.

4. Disección y electroporación (en vídeo)

1. Después de la eutanasia de una mujer embarazada, la disección de embriones a cabo en el hielo completos HBSS fría. Keep cada embrión en sus sacos placentarios individuales.
2. Disección del embrión y se cortará la cabeza después de la primera vértebra. Tenga en hielo completos HBSS fría.
3. Para inyección, poner la cabeza sobre un trozo de Parafilm en la parte superior de una placa de Petri. Usando una jeringa Hamilton por encargo (ver Tabla I) se inyectan de 6 a 8 l de ADN: mezcla rápida tinte verde a través del tercer ventrículo con el fin de completar los dos ventrículos laterales en las vesículas corticales. Alternativamente, la inyección puede hacerse directamente en cada ventrículo lateral.
4. Para la electroporación ex vivo, el uso de la BTX-pinza electrodos de platino. Colocar el electrodo positivo hacia el lado de la corteza que desea electroporate superior es decir, de la cabeza de la corteza dorsal.
5. Después de la electroporación, se incuban las cabezas en hielo durante al menos 5 minutos antes de la disección.
6. Dissect cerebros en HBSSby hielo frío haciendo una pequeña incisión en el lado de la cabeza y el pelado de la piel de los lados de la cabeza. A continuación, conunas pinzas finas pelar suavemente lejos de la pia del cerebro. Retire el cerebro intacto del cráneo, teniendo cuidado de no dañar la corteza.

5. Inclusión y corte de las cortezas electroporados (en vídeo)

1. Transferir 3% de agarosa de bajo punto de fusión en un molde grande se coloca en hielo. La parte inferior del molde comenzar a solidificarse más rápido que evite los cerebros se hunda hasta el fondo del molde. Suavemente, transferir el cerebro con unas pinzas finas, uno por uno después de retirar el exceso de tampón con un Kimwipe o papel de filtro. Utilice una punta de pipeta de 10 l en forma de remolino los cerebros en el interior del molde para asegurar la máxima operatividad entre la agarosa y el tejido cerebral.
2. Oriente el cerebro para asegurar que todos los cerebros están en la misma orientación y en el mismo nivel en la agarosa. Que la agarosa solidificar durante aproximadamente 5 minutos. Utilice adhesivo (cola loca) para fijar los bloques de agarosa para que los bulbos olfativos están de pie. Una vez que los bloques están unidos, de inmediato añadoce HBSS fría y recortar la agarosa para asegurarse de que cada rebanada, se obtienen para cada cerebro.
3. Para cortar los bloques, establece la velocidad de la vibrátomo a una velocidad baja (aproximadamente la mitad del máximo) y establecer la frecuencia de vibración de los álabes en la posición más alta. Generar 250-micras rodajas gruesas coronal. Recuperar las rebanadas con una espátula fina doblada y transferirlos a los pozos de tejido con un pincel fino o con fórceps.
4. En la campana de cultivo de tejidos, transferir las rebanadas en los insertos recubiertos. Añadir 500 l de medio de cultivo a cada rebanada de inserción para facilitar los traslados. Hasta 5 rebanadas puede ser colocado por inserción. Quite el exceso de la parte superior de las rebanadas y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado.

6. Cultura y Análisis de Sectores organotípicos (en vídeo)

1. A fin de mantener las rebanadas sanos, los medios frescos deben añadirse al menos cada dos días debajo de la membrana mediante la sustitución de la mitad de los medios de comunicación cada vez.
2. Con el fin de analizar las rebanadas después de la deseado día en la cultura, arreglar las rebanadas en la membrana. Lavar con 1 x tampón fosfato salino (PBS) a 37 ° C tres veces durante 10 minutos cada vez. A continuación, fijar con paraformaldehído al 4% (PFA) durante la noche a 4 ° C o durante 1 hora a temperatura ambiente.
3. Las rebanadas se pueden analizar con diferentes marcadores celulares o teñidas con Hoechst solo para visualizar las células electroporated y no electroporado. Permeabilizar y bloquear rodajas durante 2 horas a temperatura ambiente con suero de cabra al 10%, 0,1% de Triton en 1x PBS con agitación suave.
4. Stain con Hoechst durante 1 hora a temperatura ambiente, se lava 3 veces con PBS 1x 10 min cada vez con agitación suave.
5. Para montar rodajas cortar la membrana con un escalpelo, y utilizar un fórceps finas para transferir la membrana que contiene las rebanadas para un vidrio esmerilado se desliza en una cámara de agua. Hasta 5 rebanadas pueden ser colocados por cada portaobjetos de vidrio. Retire el exceso de agua, y añadir una gota de solución Flourmount a cada sector del cerebro. Con suavidad, coloque un cubreobjetos encima de las rodajas de cerebro y eliminar uny las burbujas de aire. Analizar las rebanadas con el microscopio confocal.

7. Inclusión en parafina de las rebanadas organotípicos alternativa (no en el vídeo)

1. Rebanadas organotípicos también puede ser embebido en parafina para un análisis más preciso morfológica, a este fin, la membrana que contiene las rebanadas organotípicos puede ser fijado en 4% PFA como se describió anteriormente.
2. Las rodajas fijas están incrustados en% de agarosa 1 (precalentado a 37 ° C), y se solidifica en hielo durante 30 minutos. Los bloques de agarosa puede ser post-fija en el 4% PFA a 4 ° C durante 30 min.
3. El bloque de agarosa que contiene la rebanada organotípico luego se incluyeron en parafina y se procesaron para inmunofluorescencia como se ha descrito previamente ^10.

8. Los resultados representativos

Una representación esquemática de la electroporación de la corteza murino y la cultura de rebanadas organotípicos se muestra en la Figura 1. Este método es una estrategia útil para rapid evaluación de la función de genes implicados en el desarrollo neuronal ^11. Dependiendo de la cantidad de ADN y electroporado la etapa embrionaria en la electroporación, la eficacia de transfección puede variar. Rebanadas comenzará expresando GFP por lo menos 8 horas después de la electroporación y las células se someterá a la secuencia normal de eventos neurogénicos (proliferación, migración y diferenciación neuronal temprana) en la cultura. La figura 2 muestra un corte de cerebro electroporado que está expresando un control pSilencer-GFP vectorial y se puede observar progenitores neuronales, las neuronas que migran y las neuronas diferenciadas en la división. Rebanadas organotípicos mantendrá su morfología, siempre que se mantengan en un buen medios de interfaz de aire en las membranas y se puede utilizar hasta por lo menos 5 días en cultivo.

Figura 1. Ilustración de la electroporación ex vivo y cortar en rodajas organotípicoensayo de cultivo. E14.5 embriones disecados, y de forma individual inyectados con ADN mezclado con colorante verde rápido para visualizar el sitio de la inyección. ADN se puede inyectar en ambos los ventrículos laterales como se muestra en la ilustración o en el tercer ventrículo con el fin de llenar los ventrículos laterales. Después de la inyección, los cerebros se electroporación con un electroporador onda cuadrada, colocando el electrodo positivo en el lado deseado del cerebro. Los cerebros están incorporados en el 3% de agarosa de bajo punto de fusión y se seccionaron utilizando un vibrátomo. 250 rodajas de cerebro micras se colocan en 0,4 micras inserta y se cultivaron hasta una semana. GFP se puede observar después de las 8 horas después de la transfección.

Figura 2. El análisis de las secciones de cerebro electroporación. Rodajas de cerebro electroporados se tiñeron de Hoescht. La corteza dorsal muestra electroporadas progenitores neuronales en la zona ventricular (VZ). Las neuronas de la cortiCal placa (CP) están delimitados por la zona marginal (MZ). Las flechas blancas muestran las neuronas que migran. En este caso, los cerebros fueron inyectados en E15.5 y electroporación con un vector de control pSilencer GFP. Las secciones representan explantes corticales 4 días después de la electroporación. Barra de escala de 100 micras.

Solución de problemas:

1. Eficacia de transfección bajo: ajustar la concentración de ADN utilizado para al menos 1 g / l. Siempre usar el ADN muy limpia a partir de una preparación máxima, si es necesario, utilice una endo-libre de Quiagen kit para purificar el ADN.
2. Las células transfectadas en un área del cerebro diferente a la deseada: Asegurarse de que los electrodos están colocados correctamente con la posición del electrodo positivo hacia el lado del cerebro que se electroporación.
3. Rebanadas organotípicos pierde la morfología: los medios de comunicación cambian todos los días y garantizar los cortes no están flotando en los medios de comunicación
4. Rebanadas salir de la agarosa, ya que se están cortando en la vibratome: Asegúrese de que una buena interfaz se hace al incrustar el cerebro en el bajo punto de fusión de agarosa.

Discusión

Estos métodos implican la electroporación ex vivo de los plásmidos que codifican ARN bicatenario horquillas ⁸ y la cultura de rebanadas organotípicos ⁴ proporcionan varias ventajas distintas. En primer lugar, estos métodos permiten una evaluación rápida de RNAi derivados de fenotipos. La inclusión de una expresión que codifica GFP cassette en el vector pSilencer mismo que contiene el promotor U6 que impulsa la doble cadena de ARN horquilla permite una rápida identificación y caracterizació...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hamilton jeringa	HAMILTON	80008	31 de calibre 0,5 pulgadas de largo, PT-4 (nivel de biselado punto), el volumen de 10ul
Tweezertrodes Platinum	BTX	45-0489	Tamaño de 5mm
ECM830 electroporador	BTX	45-0002
BTX pedal	BTX	45-0208	Para el uso con ECM830 electroporador
Vibrante microtomo la hoja	LEICA	VT1000 S
6 - plato bien para su uso con insertos	FALCON	353502	Contiene muescas para encajar insertos
Insertos de cultivo de tejidos	FALCON	353090	0,4 micrómetros
Fast Green	SIGMA	F7252
Agarosa de bajo de fusión	FISHER	BP165-25	ADN de grado
La laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P5899
Medio Basal de Eagle	Sigma Aldrich	B-1522
10x HBSS sin Ca y Mg	GIBCO	14180-046
HEPES libre de ácido	Sigma-Aldrich	H4034