Para llevar a cabo una evaluación rápida de la función de los genes en el desarrollo de la corteza cerebral, se describen procedimientos que implican la Ex vivo de plásmidos co-expresión de inhibitoria ARN (RNAi), y las buenas prácticas agrarias en la corteza de embriones de ratón. Este protocolo se presta al estudio de diversos aspectos de neurodesarrollo, tales como la neurogénesis, la migración neuronal y la morfogénesis neuronal incluida la dendrita y axón.
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Artículo de método
Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:
En este artículo
Resumen
Resumen
La corteza cerebral dirige las funciones cognitivas superiores. Esta estructura seis capas se genera en el interior de un primer, fuera-última forma, en el que las neuronas primeros nacidos permanecen más cerca al ventrículo, mientras que las neuronas últimos nacidos migran más allá de las neuronas primeros nacidos hacia la superficie del cerebro 1. Además de la migración neuronal 2, un proceso clave para la función cortical normal es la regulación de la morfogénesis neuronal 3. Si bien la morfogénesis neuronal puede ser estudiado in vitro en cultivos primarios, hay mucho que aprender de cómo estos procesos están regulados en los entornos de tejidos.
Se describen las técnicas para analizar la migración neuronal y / o la morfogénesis en rodajas organotípicos de la corteza cerebral 4,6. Un vector pSilencer modificado se usa que contiene tanto un promotor U6 que impulsa el ARN de doble hebra de horquilla y un casete de expresión independiente que codifica la proteína GFP impulsado bya promotor CMV 7-9. Nuestro enfoque permite la evaluación rápida de los defectos en el crecimiento de las neuritas en caída específica de genes candidatos y ha sido utilizado con éxito en una pantalla para que los reguladores de crecimiento de las neuritas 8. Debido a que sólo un subconjunto de células se expresan las construcciones RNAi, las rebanadas organotípicos permitir un análisis del mosaico de los fenotipos posibles. Además, debido a este análisis se realiza en una aproximación cercana del entorno in vivo, que proporciona un bajo coste y rápida alternativa para la generación de animales transgénicos o knockout para los genes de función desconocida cortical. Finalmente, en comparación con la tecnología de electroporación in vivo, el éxito de los ex experimentos in vivo electroporación no depende de desarrollo proficiente habilidad cirugía y se puede realizar con un tiempo de formación más cortos y habilidad.
Protocolo
1. Preparación de Soluciones de Cultura y Medios de Comunicación (no en el vídeo)
- Preparar 1 litro de solución salina equilibrada completa de Hank (HBSS) que contiene HBSS 1x, 2.5 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM de D-glucosa, 1 mM CaCl 2, 1 mM de MgSO 4 y 4 mM NaHCO 3. Agregue el agua doblemente destilada (DDC 2 O). Filtrar con un filtro de esterilización de 0,2 micras y se almacena a 4 º C.
- Para preparar el medio de cultivo utilizando rebanada 35 ml de Medio Basal de Eagle medios, 12,9 ml de HBSS completos, 20 mM de D-glucosa (1,35 ml de solución 1 M), 1 mM de Glutamax (0,25 ml de una solución 200 mM), 0,5 ml....
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Discusión
Estos métodos implican la electroporación ex vivo de los plásmidos que codifican ARN bicatenario horquillas 8 y la cultura de rebanadas organotípicos 4 proporcionan varias ventajas distintas. En primer lugar, estos métodos permiten una evaluación rápida de RNAi derivados de fenotipos. La inclusión de una expresión que codifica GFP cassette en el vector pSilencer mismo que contiene el promotor U6 que impulsa la doble cadena de ARN horquilla permite una rápida identificación y caracterizació.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Dra. Shirin Bonni para proporcionar la construcción pSil-GFP, el Dr. Alper Uzun para la ilustración de la Figura 1, y la instalación de Bioimagen Leduc para la microscopía confocal. EMM es apoyado por el premio a la Trayectoria para la ciencia médica con cargo al Fondo Burroughs Wellcome, un premio NARSAD de Jóvenes Investigadores, y el NIH CNRR COBRE RR018728 P20-01. SBL es apoyado por el NIH CNRR COBRE RR018728 P20-01, y ha recibido el apoyo de PHS NRSA 5T32MH019118-20.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Hamilton jeringa | HAMILTON | 80008 | 31 de calibre 0,5 pulgadas de largo, PT-4 (nivel de biselado punto), el volumen de 10ul |
| Tweezertrodes Platinum | BTX | 45-0489 | Tamaño de 5mm |
| ECM830 electroporador | BTX | 45-0002 | |
| BTX pedal | BTX | 45-0208 | Para el uso con ECM830 electroporador |
| Vibrante microtomo la hoja | LEICA | VT1000 S | |
| 6 - plato bien para su uso con insertos | FALCON | 353502 | Contiene muescas para encajar insertos |
| Insertos de cultivo de tejidos | FALCON | 353090 | 0,4 micrómetros |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Agarosa de bajo de fusión | FISHER | BP165-25 | ADN de grado |
| La laminina | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Medio Basal de Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| 10x HBSS sin Ca y Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES libre de ácido | Sigma-Aldrich | H4034 |
Referencias
- Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci....
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Reimpresiones y permisos
