Un enfoque para el análisis de la migración y el destino final de las aves las células de la cresta neural en la codorniz, pollo embriones quiméricos se describe. Este método es una técnica simple y directa para el seguimiento de las células de la cresta neural durante la migración y la diferenciación que son difíciles de distinguir dentro de un embrión de pollo no manipulado.
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Artículo de método
Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante
En este artículo
Resumen
Resumen
Embriones de aves proporcionar una plataforma única para el estudio de muchos procesos de desarrollo de vertebrados, debido a la facilidad de acceso de los embriones dentro del huevo. Quiméricos embriones de aves, en los que se trasplantan tejidos de donantes de codorniz en un embrión de pollo in ovo, se combinan el poder de etiquetado indeleble genética de las poblaciones de células con la facilidad de manipulación presentada por el embrión aviar.
Pollo Codorniz-quimeras son una herramienta clásica para el seguimiento de las células migratorias de la cresta neural (CCN) 1-3. NCC son una población flotante migratorio de las células en el embrión, que se originan en la región dorsal del tubo neural en desarrollo 4. Se someten a un epitelio mesenquimal de transición y posteriormente migrar a otras regiones del embrión, donde se diferencian en varios tipos de células incluyendo el cartílago 5-13, 11,14-20 melanocitos, neuronas y células de 21-32. NCC son multipotentes, y su destino final es influirinfluenciados por 1) la región del tubo neural en el que se originan a lo largo del eje rostro-caudal del embrión 11,33-37, 2) las señales de las células vecinas a medida que migran 38-44, y 3) el microambiente de su última destino en el embrión 45,46. Seguimiento de estas células desde su punto de origen en el tubo neural, a su posición final y el destino en el embrión, aporta datos importantes en los procesos de desarrollo que regulan los patrones y la organogénesis.
El trasplante de regiones complementarias del tubo neural de los donantes (homotópica injerto) o las diferentes regiones del tubo neural del donante (injerto heterotópico) puede revelar las diferencias en la pre-especificación de los países contribuyentes netos a lo largo del eje rostro-caudal 2,47. Esta técnica puede ser adaptado para el trasplante unilateral de un compartimiento del tubo neural, de tal manera que una parte se deriva de tejido de un donante, y los restos lado contralateral imperturbable en el embrión de acogida, yiElding un control interno dentro de la misma muestra, 2,47. También se puede adaptar para el trasplante de segmentos cerebrales de embriones posteriores, después de HH10, cuando el tubo neural anterior ha cerrado 47.
Aquí mostramos las técnicas para la generación de pollos de codorniz-quimeras mediante el trasplante del tubo neural, lo que permite el seguimiento de los países contribuyentes netos migratorios derivados de un segmento discreto del tubo neural. Específicos de una especie de etiquetado de las células derivadas del donante con el anticuerpo específico de la codorniz QCPN 48-56 permite al investigador para distinguir los donantes y las células huésped en el punto final experimental. Esta técnica es sencilla, barata y tiene muchas aplicaciones, incluyendo el destino de mapeo, linaje de células de seguimiento, y la identificación de pre-eventos de modelado a lo largo del eje rostro-caudal 45. Debido a la facilidad de acceso para el embrión aviar, la técnica de injerto codorniz-polluelo puede combinarse con otras manipulaciones, incluyendo pero no limitado a ablación lente 40, la inyección de moléculas inhibidoras 57,58, o la manipulación genética a través de electroporación de 59-61 plásmidos de expresión, para identificar la respuesta de determinados flujos migratorios de los países contribuyentes netos a las perturbaciones en el programa de desarrollo del embrión. Además, esta técnica de injerto también puede utilizarse para generar otros embriones interespecíficos quiméricos tales como codorniz-pato quimeras para estudiar la contribución NCC a la morfogénesis craneofacial, o quimeras pollo ratón para combinar el poder de la genética del ratón con la facilidad de manipulación del embrión aviar 62.
Protocolo
1. Incubar de pollo y huevos de codorniz a la etapa deseada
Para HH9 embriones, los tiempos típicos de incubación van desde 29-33 horas a 38 ° C. 63
- Lave todos los residuos de los huevos con agua tibia.
- Organizar los huevos de gallina en la bandeja en posición horizontal. Marcar la cara superior con lápiz; esto corresponderá a la región donde se localiza el embrión. Incubar los huevos de codorniz final contundente arriba.
- Lugar en los 38 ° C humidificado incubadora. Encienda la función de balanceo.
2. Prepare los huevos de ventanas y la disección
- Retir....
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Discusión
El injerto de tubo neural codorniz en embriones de pollo de acogida se describe aquí es una técnica sencilla y de bajo costo para el seguimiento de subpoblaciones específicas de la migración de los países contribuyentes netos provenientes de diferentes regiones a lo largo del eje rostro-caudal 21,67-69. Esta técnica aprovecha las ventajas de la facilidad de acceso a los embriones aviares (en comparación a los embriones de mamíferos) y se puede combinar con otras técnicas, tales como la ablación del tejido, la.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Lwigale para la crítica del manuscrito. SLG se apoya en una Ruth L. Kirschstein NRSA beca del National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL es apoyada por el National Eye Institute (EY018050).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Los huevos del polluelo | Varios - usamos la Texas A & M University, Departamento de Ciencias Avícolas, TX. | ||
| Huevos de codorniz | Varios - usamos Empresa Ozarks huevo, MO. | ||
| Huevo de incubadora (Lectura Digital 1502 Sportsman Incubadora w / Humedad de 110-120 voltios de CA) | www.poultrysupply.com | 1502 | |
| Dumont AA fórceps, Inox con recubrimiento epóxico | Herramientas de Bellas Ciencia | 11210-10 | |
| Cinta adhesiva | Cualquier tienda de suministros de oficina | ||
| Curva pinza Iris | Herramientas de Bellas Ciencia | 11065-07 | |
| Yondia de tinta | Cualquier tienda de arte | ||
| Penicilina / estreptomicina (penicilina, estreptomicina) Solución | VWR International | 101447-068 | |
| La cinta de embalaje transparente | Cualquier tienda de suministros de oficina | ||
| Aguja aparato tirando | Narashige, Japón | PE-21 | |
| Vidrio sacó la aguja, hizo 1,5 a 1,8 x 100 mm tubo de vidrio de borosilicato capilar | Kimble Chase, | 34500 99 | |
| Tirado pipeta de vidrio, a partir de 5 ¾ "pipeta Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Boca pipeta de aparatos (montaje de aspiración del tubo de pipeta calibrada microcapilar) | Sigma-Aldrich | A5177-52A | |
| Dumont n º 5 con fórceps | Herramientas de Bellas Ciencia | 11251-30 | |
| Tonelalambre de gsten, diámetro 0,1 mm | VWR International | AA10404-H2 | |
| Los porta-agujas (niquelado soporte del pasador) | Herramientas de Bellas Ciencia | 26018-17 | |
| QCPN antisuero | Hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, de la Universidad de Iowa. | QCPN | |
| Alexa Fluor anticuerpo secundario (por ejemplo, Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón IgG1) | Invitrogen | A21125 | |
Solución de Ringer (2L):
| Todos los reactivos de Fisher Scientific |
|
Referencias
- Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol.
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Reimpresiones y permisos
