Aquí se describe la primera práctica de fabricación (GMP)-cumple método de producción de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de la sangre del cordón umbilical, una fuente de células T predominantemente ingenuo.
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Artículo de método
La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y
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Resumen
Resumen
Las infecciones de virus después de un trasplante de células madre se encuentran entre las causas más comunes de muerte, sobre todo después de la sangre del cordón (CB) trasplante (CBT), donde el CB no contiene cantidades apreciables de células T del virus con experiencia que pueden proteger al destinatario de la infección 1. - 4 Nosotros y otros han demostrado que el virus de CTL específico generado a partir de donantes seropositivos y se infunde al destinatario son seguros y protectores. 5-8 Sin embargo, hasta hace poco, virus específicos de las células T no podría ser generado a partir de sangre de cordón, probablemente debido a la ausencia de virus específicos de las células T de memoria.
En un esfuerzo para imitar mejor las condiciones en el cebado in vivo de las células T vírgenes, se estableció un método que utiliza CB-derivados de las células dendríticas (DC) transducidas con un vector adenoviral (Ad5f35pp65) que contiene el antígeno inmunodominante CMV pp65, por lo tanto, conducir especificidad de las células T hacia CMV y adenovirus. 9 Al inicio, utilizamos estas máquinasDCs estructurados, así como CB derivados de células T en la presencia de las citoquinas IL-7, IL-12 e IL-15. 10 En la segunda estimulación se utilizó el EBV de células B transformadas, o EBV-LCL, que expresan tanto latente y antígenos para el VEB lítico. Ad5f35pp65-EBV-LCL transducidas se utilizan para estimular las células T en presencia de IL-15 en la segunda estimulación. Estimulaciones posteriores utilizar Ad5f35pp65-EBV-LCL transducidas y IL-2.
De 50x10 6 células mononucleares CB somos capaces de generar más de 150 x 10 6 virus específicos de las células T que lisan los impulsos de antígeno-objetivos y liberación de citoquinas en respuesta a la estimulación antigénica. 11 Estas células se fabrican de una manera GMP usando sólo la fracción de 20% de una unidad de sangre de cordón se fraccionó y se han traducido para el uso clínico.
Protocolo
1. Aislamiento de células mononucleares (día 0)
- Insertar espiga de adaptador luer hembra en el puerto de salida de la fracción de 20% de la unidad de sangre del cordón umbilical, conecte la jeringa y retirar la sangre. Transferir sangre descongeladas a 20 ml de RPMI calentó en tubo de centrífuga 50 mL. Enjuague la bolsa de sangre de cordón con 5 ml de RPMI y transferir al tubo de centrífuga mismo.
- Centrifugar las células durante 10 minutos a 400 x g. Aspirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 20 ml de RPMI caliente. Células de capa en 15 ml de Lymphoprep en 50 ml tubo de centrífuga. Centrifugar 40 minutos a 400 x g.
- C....
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Discusión
Las actuales estrategias encaminadas a controlar las infecciones virales después de la TCC puede ser eficaz, pero están asociados con toxicidades significativas, son caros, y no confieren protección a largo plazo contra la infección posterior. De hecho, el uso de algunos fármacos antivirales pueden limitar la expansión de las células T específicas de virus que de otro modo serían de protección. 14 Otra opción es la infusión de las células derivadas del donante T específicos para el virus. Nosotros y otr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por un Dan L. Duncan beca de investigación colaborativa (CMB y EJS), el Instituto Nacional del Corazón Pulmón, y Sangre (US4HL081007), una Sociedad de Leucemia y Linfoma Investigación Clínica premio Scholar (CMB), y el Instituto Nacional del Cáncer (RO1 CA06150816; EJS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC medios de comunicación | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Medio de Click) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Suero Humano | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Gas Permeable Cultureware 18 | Wilson-Wolf | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Farmacia) | ||
| IL-12 | NCI / CTEP | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | De I + D | AFL207 | |
| IL-1 beta | De I + D | AFL201 | |
| IL-6 | CélulaGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Farmacia | ||
| IL-4 | De I + D | AFL204 | |
| TNF-alfa | De I + D | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM Vector CAGT Instalaciones de Producción | ||
| Transferencia de plasma con adaptador luer hembra | Carta Médica | 89-550-66J | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
Referencias
- Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, ....
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Reimpresiones y permisos
