Artículo de método
Los explantes procedentes del sistema de la dopamina mesencéfalo y el cuerpo estriado se utilizan en un ensayo para la matriz de colágeno In vitro Análisis del desarrollo y la vía mesoestriatales estriatonigral. En este ensayo crecimiento axonal y orientación puede ser manipulado y cuantificados. También se puede modificar para evaluar otras regiones o señales moleculares.
La dopamina del cerebro medio (MDDA) neuronas se proyectan a través del haz medial del cerebro anterior hacia varias áreas en el telencéfalo, incluyendo el cuerpo estriado 1. Recíprocamente, las neuronas espinosas medias en el cuerpo estriado que dan lugar a la estriatonigral (directa) y la vía inervan la sustancia negra 2. El desarrollo de estas extensiones del axón depende de las acciones de combinatorias de una gran cantidad de crecimiento de los axones y las señales de orientación que incluyen moléculas que se liberan por neuritas o por regiones de destino (nivel intermedio) de 3,4. Estos factores solubles pueden ser estudiados in vitro por MDDA cultivo y / o explantes estriatales en una matriz de colágeno que proporciona un sustrato tridimensional para los axones que imitan el entorno extracelular. Además, la matriz de colágeno permite la formación de gradientes relativamente estables de proteínas liberadas por explantes otras células y colocados en la proximidad (por ejemplo, véanse las referencias 5 y 6). Aquí se describen los métodos para las comficación de colágeno de cola de rata, microdisección de los explantes dopaminérgicos del cuerpo estriado, y, de su cultura en geles de colágeno y su posterior análisis inmunohistoquímico y cuantitativo. En primer lugar, los cerebros de embriones de ratón E14.5 están aislados y dopaminérgico estriatal y los explantes se microdissected. Estos explantes son entonces (co) cultivadas en geles de colágeno en cubreobjetos de 48 a 72 horas in vitro. Posteriormente, las proyecciones axonales se visualizan utilizando marcadores neuronales (por ejemplo, la tirosina hidroxilasa, DARPP32 o tubulina βIII) y crecimiento de los axones y las respuestas de los axones atractivas o repulsivas son cuantificados. Esta preparación neuronal es una herramienta útil para los estudios in vitro de los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento de los axones y mesoestriatales estriatonigral y orientación durante el desarrollo. Utilizando este ensayo, también es posible evaluar otros (intermedio) objetivos para los axones dopaminérgicos y estriado o para probar específicos señales moleculares.
1. Preparación de colágeno de rata cola
La disección de las colas de rata (en la campana de cultivo de tejidos):
(Mantener las herramientas en el 70% de etanol, cuando no usarlos y asegúrese de que todas las soluciones, herramientas y material de vidrio se utilizan en este procedimiento son estériles)
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
El ensayo de matriz de colágeno se describe aquí se ha utilizado y mejorado por muchos laboratorios diferentes en las últimas décadas para investigar una variedad de moléculas de guiado de los axones neuronales y sistemas (por ejemplo, véanse las referencias 5-8). Estos estudios han demostrado que este ensayo es una poderosa herramienta para estudiar los efectos y la regulación de las moléculas de orientación axón secretadas por diferentes tejidos diana (intermedio).
Sin embargo, debe teners.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
No tenemos nada que revelar.
El ensayo de matriz de colágeno se ha desarrollado y mejorado por el trabajo de muchos grupos de investigación durante los últimos dos o tres décadas. Los enfoques descritos aquí para explantes dopaminérgicos del cuerpo estriado, y se benefician enormemente de estos estudios. Además, los autores desean agradecer a Asheeta Prasad por su ayuda en la creación de culturas del cuerpo estriado de explantes. El trabajo en el laboratorio fue financiado por la organización del programa Human Frontier Science (Premio a la Trayectoria para el Desarrollo), la Organización Holandesa de Investigación en Salud y el Desarrollo (ZonMW-VIDI y ZonMW TOP), la Unión Europanian (MDDA-Neur....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| De suero fetal bovino | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamina (200 mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-mercaptoetanol | Merck | 444203 | |
| Mínimos medios esenciales (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz medio L-15 | Gibco | 11415-049 | |
| La penicilina-estreptomicina | Gibco | 15070-063 | |
| Prolongar reactivo Antifade Oro | Invitrogen | P36930 | |
| Diálisis tubo | Spectrum Labs | 132660 | |
| De conejo anti-tirosina hidroxilasa | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Conejo anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-tubulina βIII | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor etiqueta secundaria de anticuerpos | Invitrogen |
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE
Solicitar permiso