La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Resumen

Trasplante de médula ósea murina es una técnica ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan injerto contra huésped enfermedad en los seres humanos. La capacidad para monitorear los patrones de tráfico de células T In vivo Permite el análisis detallado del desarrollo y perpetuación de la respuesta de células T durante la enfermedad de injerto contra huésped.

Resumen

Enfermedad de injerto contra huésped (EICH) es la barrera limitante para el uso amplio de trasplante de médula ósea como terapia curativa para una variedad de deficiencias hematológicas. GVHD es causada por las células T maduras alorreactivas presentes en el injerto de médula ósea que se infunden en el receptor y causar daños en los órganos receptores. Sin embargo, en ratones, las células T se debe añadir al inóculo de médula ósea a causan la GVHD. Aunque extenso trabajo que se ha hecho para caracterizar células T después del trasplante, respuestas, bioluminiscente tecnología de imagen es un método no invasivo para monitorizar los patrones de tráfico de células T in vivo.

Después de la irradiación letal, los ratones receptores se trasplantan con células de médula ósea y esplenocitos de ratones donantes. Subconjuntos de células T de L2G85.B6 (ratones transgénicos que expresan constitutivamente luciferasa) se incluyen en el trasplante. Por sólo trasplantar ciertos subconjuntos de células T, uno es capaz de rastrear específicos subconjuntos de células T in vivo,y en base a su ubicación, el desarrollo de hipótesis con respecto a la función de subconjuntos de células T específicas en la promoción de la GVHD en diversos puntos temporales. En trasplante predeterminado después de intervalos, los ratones receptores son imágenes utilizando una cámara CCD Xenogen IVIS. La intensidad de luz puede ser cuantificado usando software Living imagen para generar una imagen de pseudo-color en función de la intensidad de fotones (rojo = alta intensidad, violeta intensidad = bajo).

Entre 4-7 días después del trasplante, los ratones receptores comienzan a mostrar signos clínicos de la GVHD. Cooke et al. ¹ desarrolló un sistema de puntuación para cuantificar la progresión de la enfermedad en función de la textura de la piel destinatario ratones, integridad de la piel, la actividad, pérdida de peso y la postura. Los ratones se obtuvo diariamente, y sacrificados cuando se convierten moribundo. Los ratones receptores se convierten generalmente en moribundo 20-30 días después del trasplante.

Los modelos murinos son herramientas valiosas para el estudio de la inmunología de la GVHD. Selectivamente trasplante particular, subconjuntos de células T almínimos para la identificación cuidadosa de las funciones que cada subconjunto juega. No invasiva seguimiento de las respuestas de células T in vivo agrega otra capa de valor para los modelos murinos GVHD.

Protocolo

1. Irradiación letal

1. Coloque hasta 10 ratones receptores en una jaula microisolator compatible con el irradiador para ser utilizado.
2. Irradiar en 2 dosis iguales de suma dosis total (dosis total = 9 cGy para los receptores BALB.B). En segundo lugar irradiación debe ser de 3 horas después de la primera. La inyección debe tener lugar entre 4-6 horas después de la irradiación final. Irradiar ratones, ya sea en origen o Cs ¹³⁷ RS2, 000 irradiador,.
3. Después de la segunda dosis de radiación, ratones tiendas en microisolator jaula con agua acidulada hasta el momento del trasplante.

2. Preparación de e....

Discusión

El protocolo para la inducción de la GVHD en ratones presentados aquí representa un modelo clínicamente relevante de GVHD murino. Originalmente establecida por Berger et al., En 1994, la C57Bl / 6 en combinación cepa BALB.B es MHC-emparejado, con una mortalidad GVHD mediada por CD4, CD8 efectoras dependientes de T ^2, muy similares a las del escenario clínico más común ^3. Se sabe que el trasplante de las células T CD8 solo no causa GVHD en este modelo, sin embargo, la progresión de la enfer.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre de Reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Invitrogen	12633-012
Suero de ternero fetal	Invitrogen	10439016
40 mM filtro de células	BD Biosciences	352340
CD3e-Biotina	Miltenyi Biotech	130-093-021
Anti-biotina microperlas	Miltenyi Biotech	130-091-147
CD8a microperlas	Miltenyi Biotech	130-049-401	Se utiliza para agotar las células T CD8 de bazo.
Purificación de anticuerpos CD8a Cocktail	Miltenyi Biotech	130-095-236	Se utiliza para purificarCélulas T CD8 de bazo.
D-luciferina	Caliper Life Sciences	122796