Artículo de método

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

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DOI:

10.3791/3702

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26 de marzo de 2012

 , 
1RNA Biology, New England Biolabs

En este artículo

Resumen

Este método describe un alto rendimiento in vitro síntesis de ARNm con caperuza y sin caperuza a partir de un plásmido linealizado que contiene el Gaussia gen luciferasa (GLuc). El ARN se purifica y una fracción del ARN sin caperuza se caperuza enzimáticamente utilizando el Vaccinia enzima de capping viral. En el paso final, el ARNm se transfecta en células HeLa y los sobrenadantes del cultivo celular se analizan para determinar la actividad de luciferasa.

Resumen

La transcripción in vitro es la síntesis de transcritos de ARN por la ARN polimerasa a partir de una plantilla de ADN lineal que contiene la secuencia promotora correspondiente (T7, T3, SP6) y el gen que se va a transcribir (Figura 1A). Una reacción típica de transcripción consta de la plantilla de ADN, ARN polimerasa, trifosfatos de ribonucleótidos, inhibidor de ARNasa y tampón que contiene iones Mg2+.

A menudo se requieren grandes cantidades de ARN de alta calidad para diversas aplicaciones. Se ha informado el uso de la transcripción in vitro en estudios sobre la estructura y función del ARN, como el empalme1, experimentos de ARNi en células de mamíferos2, amplificación de ARN antisentido mediante el "método Eberwine"3, análisis con microarreglos4 y estudios sobre vacunas de ARN5. La técnica también puede utilizarse para producir sondas marcadas con radioisótopos y con colorantes6. Warren, et al. recientemente informaron la reprogramación de células humanas mediante transfección con ARN con caperuza transcrito in vitro7. El Kit de Síntesis de ARN de Alto Rendimiento T7 de New England Biolabs ha sido diseñado para sintetizar hasta 180 μg de ARN por reacción de 20 μl. Se ha logrado transcribir con éxito ARN de hasta 10 kb de longitud utilizando este kit. Se puede utilizar ADN plasmídico linealizado, productos de PCR y oligonucleótidos de ADN sintéticos como plantillas para la transcripción, siempre que contengan la secuencia promotora T7 ubicada aguas arriba del gen que se va a transcribir.

La adición de una estructura de caperuza en el extremo 5' del ARN es un proceso importante en los eucariotas. Es esencial para la estabilidad del ARN8, la traducción eficiente9, el transporte nuclear10 y el empalme11. El proceso implica la adición de una caperuza de 7-metilguanosina en el extremo con tri fosfato 5' del ARN. La caperuza del ARN se puede llevar a cabo post-transcripcionalmente utilizando enzimas de caperuza o co-transcripcionalmente usando análogos de caperuza. En el método enzimático, el ARNm se caperuza utilizando la enzima de caperuza del virus de la Vaccinia12,13. La enzima añade una caperuza de 7-metilguanosina en el extremo 5' del ARN utilizando GTP y S-adenosil metionina como donadores (estructura cap 0). Ambos métodos producen ARN caperuzado funcionalmente activo, adecuado para transfección u otras aplicaciones14, como la generación de ARN genómico viral para sistemas de genética inversa15 y estudios cristalográficos de proteínas que se unen a la caperuza, tales como eIF4E16.

En el método descrito a continuación, se utiliza el Kit de Síntesis de ARN de Alto Rendimiento T7 de NEB para sintetizar transcritos de ARN con caperuza y sin caperuza de luciferasa de Gaussia (GLuc) y luciferasa de Cypridina (CLuc). Una porción del ARN de GLuc sin caperuza se caperuza utilizando el Sistema de Caperuzamiento Vaccinia (NEB). Se emplea como molde de ADN un plásmido linealizado que contiene el gen de GLuc o CLuc y un promotor T7. El ARN transcrito se transfecta en células HeLa y los sobrenadantes del cultivo celular se analizan para determinar la actividad luciferasa. El ARN de CLuc con caperuza se utiliza como control interno para normalizar la expresión de GLuc.

Protocolo

Las RNasas están comúnmente presentes en la piel, el cabello, el polvo, las superficies de laboratorio, las soluciones, etc. Use guantes y limpie minuciosamente la superficie del banco, las pipetas, etc. antes de usarlos para evitar la contaminación con RNasas. Se recomienda encarecidamente el uso de puntas de pipeta, tubos, material de vidrio y reactivos libres de nucleasas.

1. Transcripción in vitro utilizando el Kit de Síntesis de ARN de Alto Rendimiento T7

La plantilla de ADN para la reacción de transcripción es un plásmido linealizado que contiene el gen de la luciferasa de Gaussia y un promotor T7 ubicado aguas arriba de la secuencia codificante (Figura 1B).

  1. Descongele los componentes del kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7 y manténgalos en hielo.
  2. Para ARN sin caperuza, prepare la reacción a temperatura ambiente en el siguiente orden:
ComponenteVolumen (μl)Final
Agua libre de nucleasas*X 
Tampón de reacción 10X21X
ATP (100 mM)210 mM
CTP (100 mM)210 mM
UTP (100 mM)210 mM
GTP (100 mM)210 mM
ADN molde *X1 μg
Mezcla de ARN polimerasa T72 
Total20 

*Añada 1 μg de ADN y complete el volumen total de la reacción hasta 20 μl con agua libre de nucleasas. La cantidad de agua que se debe añadir variará según la concentración del ADN molde.

  1. Para ARN con caperuza: Preparar la reacción a temperatura ambiente en el siguiente orden:
ComponenteVolumen (μl)Final
Agua libre de nucleasas*X 
Tampón de reacción 10X21X
ATP (100 mM)210 mM
CTP (100 mM)210 mM
UTP (100 mM)210 mM
GTP (20 mM)22 mM
Análogo de capuchón 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA) (40 mM)48 mM
ADN molde*X1 μg
Mezcla de ARN polimerasa T72 
Total20 

*Añada 1 μg de ADN y complete el volumen total de reacción hasta 20 μl con agua libre de nucleasas. La cantidad de agua que se debe añadir variará según la concentración del ADN molde.

  1. Mezcle bien mediante vortex y lleve las reacciones a incubar durante 2 horas a 37 °C en un incubador de aire seco.
  2. Mediante los pasos 1.3-1.4, sintetice transcritos con caperuza de luciferasa de Cypridina (CLuc) a partir de un plásmido linealizado que contenga el gen CLuc. Este ARNm se transfectará conjuntamente con el ARNm de GLuc con caperuza y sin caperuza para normalizar la expresión de GLuc.

2. Eliminación del ADN molde

Las reacciones de transcripción se tratan con DNasa I para eliminar la plantilla de ADN antes de proceder con la purificación.

  1. Añada 70 μl de agua libre de nucleasas a las reacciones de transcripción, seguido de 10 μl de tampón de reacción de DNasa I.
  2. Añada 2 μl de DNasa I a las reacciones.
  3. Incube a 37 °C durante 15 minutos en un incubador de aire seco.

3. Purificación por columna de ARN con caperuza y sin caperuza

  1. Purifique el ARN con caperuza y sin caperuza utilizando el MEGAclearKit según las instrucciones del fabricante (puede usarse cualquier kit de purificación de ARN basado en columnas de centrifugación).
  2. Cuantifique el ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop.
  3. Evalúe la calidad de la muestra de ARN según las instrucciones del fabricante utilizando el Agilent RNA 6000 Nano Kit y el Agilent 2100 Bioanalyzer.

4. Capado de ARN utilizando el sistema de capado de Vaccinia

  1. Tome 10 μg de ARNm GLuc purificado sin capuchón.

Una reacción de capping estándar puede agregar una cofia a hasta 10 μg de ARN (de 100 nt o mayor). Si es necesario agregar la cofia a una cantidad mayor de ARN, la reacción puede escalarse proporcionalmente.

  1. Aumente el volumen a 15 μl utilizando agua libre de nucleasas.
  2. Caliente el ARN a 65 °C durante 10 minutos para eliminar las estructuras secundarias. Coloque en hielo durante 5 minutos.
  3. Para preparar la reacción de capping, añada 2 μl de tampón de capping 10X, 1 μl de GTP (10 mM), 1 μl de S-adenosil metionina recién diluida (2 mM) y 1 μl (10 unidades) de enzima de capping de vaccinia al ARN desnaturalizado de 15 μl.
  4. Mezcle bien mediante vortex suave e incube la reacción a 37 °C durante 30 minutos en un incubador de aire seco.

5. Purificación por columna de ARN con caperuza

  1. Purifique el ARN con caperuza utilizando el Kit MEGAclear (puede usarse cualquier kit de purificación de ARN basado en columnas de centrifugación).
  2. Según las instrucciones del fabricante, evalúe la calidad de la muestra de ARN utilizando el Kit Agilent RNA 6000 Nano y el Agilent 2100 Bioanalyzer.

6. Transfección de células HeLa utilizando el kit de transfección de ARNm TransIT

  1. Siembre células HeLa en una placa de 48 pocillos con 150 μl de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), alto en glucosa, suplementado con 10% de suero bovino fetal (0,7-2,3 × 105 células/pocillo).
  2. Incube durante 16-24 horas a 37 °C para que las células alcancen una confluencia del 60-90%.
  3. Diluya el ARN de GLuc (con capuchón y sin capuchón) y el ARN de CLuc hasta una concentración de 100 ng/μl.

Cada transfección se realiza en réplicas de 8.

  1. Preparar 8 tubos eppendorf tubos. A cada tubo añada 1 μl ARN GLuc sin capuchón, 1 μl ARN CLuc con capucha (para normalización) y 25 μl de DMEM sin suero. Mezclar bien.
  2. Prepare 8 tubos eppendorf. A cada tubo añada 1 μl ARN GLuc con caperuza (análogo de caperuza), 1 μl ARN CLuc con capuchón (para normalización) y 25 μl de DMEM sin suero. Mezclar bien.
  3. Prepare 8 tubos eppendorf. A cada tubo añada 1 μl ARN GLuc con capuchónVaccinia), 1 μl ARN CLuc con caperuza (para normalización) y 25 μl de DMEM sin suero. Mezclar bien.
  4. Añadir 0.2 μl Reagente de refuerzo de ARNm al primer conjunto de 8 tubos y mezclar.
  5. Añadir 0.2 μl TransIT mRNA Reactivo al primer conjunto de 8 tubos y mezclar.
  6. Incubar a temperatura ambiente durante 2-5 minutos. (No incubar más de 5 minutos).
  7. Añada la mezcla de transfección gota a gota a los pocillos que contienen cultivos de células HeLa (consulte Figura 3 para la preparación de la placa).
  8. Repita los pasos 7 a 10 con el 2nd y 3rd conjuntos de 8 tubos
  9. Incubar durante la noche (16 horas) a 37 °C en 5% CO2.

7. Ensayo de luciferasa de Gaussia (GLuc)

Analice el sobrenadante de cada pocillo para determinar la actividad de GLuc utilizando el kit de ensayo de luciferasa Gaussia BioLux de la siguiente manera:

  1. Preparar la solución de ensayo fresca añadiendo 15 μl de sustrato BioLux GLuc a 1,5 ml de tampón de ensayo BioLux GLuc (se requieren 50 μl de solución de ensayo por muestra). Preparar suficiente cantidad para las muestras y para cebado del inyector del luminómetro (consultar las instrucciones del fabricante).
  2. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces (no usar vórtex).

La luminiscencia se mide utilizando el luminómetro de microplacas Centro LB 960 de Berthold Technologies.

  1. Configure el luminómetro a un volumen de inyección de 50 μl y una integración de 2-10 segundos.
  2. Agregue 10 μl del sobrenadante del cultivo celular de cada pocillo a una placa negra de 96 pocillos.
  3. Prepare el inyector con la solución del ensayo y continúe con la medición de la luminiscencia.
  4. Los valores obtenidos de los pocillos no transfectados se utilizarán como controles negativos.

8. Ensayo de luciferasa de Cypridina (CLuc)

Analice el sobrenadante de cada pocillo para determinar la actividad de CLuc utilizando el kit de ensayo de luciferasa Cypridina BioLux de la siguiente manera:

  1. Prepare el sustrato recién reconstituido (100x) según las instrucciones proporcionadas en el manual del kit.
  2. Deshiele el tampón de ensayo de luciferasa BioLux Cypridina y mezcle bien (proteja de la luz).
  3. Para preparar la solución de ensayo CLuc, añada 15 μl del sustrato reconstituido (100x) a 1,5 ml del tampón de ensayo de luciferasa BioLux Cypridina (se requieren 50 μl de solución de ensayo por muestra). Prepare la cantidad suficiente para las muestras y para cebado del inyector del luminómetro (consulte las instrucciones del fabricante).
  4. Mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces (no use vórtex).
  5. Mantenga la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos (proteja de la luz).

La luminiscencia se mide utilizando el luminómetro de microplacas Centro LB 960 de Berthold Technologies.

  1. Configure el luminómetro para una inyección de 50 μl, con un retraso de 1-2 segundos y una integración de 2-10 segundos.
  2. Añada 10 μl del sobrenadante del cultivo celular de cada pocillo en una placa negra de 96 pocillos.
  3. Prepare el inyector con la solución del ensayo CLuc y mida la luminiscencia.
  4. Los valores obtenidos de los pocillos no transfectados se utilizarán como controles negativos.

9. Resultados representativos

El Kit de Síntesis de ARN de Alta Rendimiento T7 puede producir hasta 180 μg de ARN sin caperuza y de 40 a 50 μg de ARN con caperuza por reacción de 20 μl. Cuando se analiza en el Bioanalizador Agilent 2100, el ARN intacto de buena calidad debe mostrar un único pico agudo que representa el transcrito de ARN. Un pico ancho o múltiples picos indican degradación del ARN. También es importante verificar el tamaño del ARN. Los transcritos de ARN más largos de lo esperado pueden deberse a una digestión incompleta del ADN plasmídico molde. La degradación del ARN y un rendimiento más bajo generalmente son resultado de contaminantes introducidos en la reacción desde el ADN molde. Figura 2 es un ejemplo del electroferograma y la imagen de gel obtenidos tras analizar ARN intacto de alta calidad en el Bioanalizador.

La transfección de células HeLa con ARN de GLuc con y sin caperuza se sigue de una incubación y la determinación de la actividad de luciferasa en los sobrenadantes del cultivo celular. La estructura de caperuza en el extremo 5' es importante para proteger el ARN frente a la degradación por exonucleasas8 y para promover la iniciación de la traducción9 del ARNm. Por lo tanto, la adición de la caperuza al ARN es un paso esencial en experimentos de transfección. El método co-transcripcional (con análogo de caperuza) produce aproximadamente 40 μg de ARN con un 80% de caperuza. El protocolo que utiliza la enzima de caperuza de Vaccinia caperuza hasta 10 μg de ARN (de 100 nt o más) por reacción con una eficiencia cercana al 100%.

Figura 4 muestra la diferencia en la expresión de luciferasa entre cultivos transfectados con muestras de ARN con caperuza y sin caperuza. Se puede observar claramente que los cultivos celulares transfectados con ARN con caperuza presentan una expresión mucho mayor de luciferasa en comparación con aquellos transfectados con ARN sin caperuza (que no muestran actividad de luciferasa). Además, Figura 4 también valida que ambas técnicas de caperuzamiento, utilizando análogo de caperuza y utilizando la enzima de caperuzamiento de la vaccinia, producen con éxito transcritos de ARN funcionales con caperuza que pueden traducirse en proteína. El valor p de dos colas obtenido a partir de la prueba t fue de 0,2583, lo que indica que no existe una diferencia estadística significativa entre los datos de luminiscencia de los dos métodos de caperuzamiento.

Diagrama de transcripción T7; plantilla de ADN, transcripción de ARN; proceso de secuencia de nucleótidos.

Figura 1A. Síntesis de ARN por la ARN polimerasa T7

Diagrama del mapa del plásmido pCMV-GLuc, 5764 pb; expresión génica, vectores de clonación, sitios de restricción.
Figura 1B. Vector pCMV-GLuc que contiene el gen GLuc y el promotor T7.

Resultados de la cromatografía de ARN; análisis de ARN con y sin caperuza; gráfico de electroforesis.
Figura 2. Electroferogramas del Bioanalizador e imagen tipo gel de ARN con y sin caperuza. El eje X representa el tamaño del ARN en nucleótidos (nt) y el eje Y representa unidades de fluorescencia (FU). A) Electroferograma de ARN mensajero de GLuc (sin caperuza) tras la purificación. B) Electroferograma de ARN mensajero de GLuc (con caperuza, utilizando la enzima de caperuza de Vaccinia). C) Electroferograma de ARN mensajero de GLuc (con caperuza, mediante síntesis co-transcripcional utilizando análogo de caperuza). D) Imagen tipo gel generada por el Bioanalizador. La raya 'L' es la escalera de ARN, la raya 1 es el ARN mensajero de GLuc sin caperuza, la raya 2 es el ARN mensajero de GLuc con caperuza utilizando el análogo de caperuza y la raya 3 es el ARN de GLuc con caperuza utilizando la enzima de caperuza de Vaccinia.

Diagrama de disposición de la placa para el experimento de expresión génica; tipos de muestras: GLuc y CLuc con capuchón y sin capuchón.
Figura 3. Ejemplo de configuración de placa para la transfección de células HeLa. Cada pocillo contiene células HeLa sembradas con una confluencia del 60-90 %. Se añade a cada pocillo la mezcla de transfección, que contiene el ARN de GLuc apropiado (sin capuchón, con capuchón mediante análogo de capuchón o con capuchón mediante enzima de encapuchado Vaccinia), el ARN de CLuc con capuchón (para normalización), el reactivo mRNA Boost y el reactivo TransIT mRNA. Cada transfección se realiza en ocho réplicas (pocillos del mismo color en la figura).

Gráfico de barras de luminiscencia normalizada; ARN GLuc con caperuza y sin caperuza; resultados del análisis de ARN.
Figura 4.Expresión de GLuc en células HeLa. Se transfirieron ARN mensajero GLuc purificado con caperuza y sin caperuza a células HeLa y se incubaron durante la noche (16 h) a 37 °C. Los sobrenadantes del cultivo celular de cada pocillo se analizaron para determinar la actividad de GLuc y CLuc, y se registraron los valores de luminiscencia. Los valores de luminiscencia de GLuc se normalizaron respecto a los valores de luminiscencia del ARN CLuc con caperuza.

Fórmula de la relación de luminiscencia GLuc, medición de luminiscencia, ecuación para valores normalizados, RLU.

* Se restó la luminiscencia de las células no transfectadas de los valores de GLuc y CLuc antes de la normalización.

Marcas registradas

BioLux es una marca registrada de New England Biolabs, Inc.

TransIT es una marca registrada de Mirus Bio LLC.

MEGAclear es una marca registrada de Ambion.

Discusión

La transcripción in vitro es un método útil para obtener altos rendimientos de ARN para diversas aplicaciones. La principal ventaja de utilizar el Kit de Síntesis de ARN de Alto Rendimiento T7 es que su formulación ha sido optimizada para lograr altos rendimientos de ARN. Además, los reactivos incluidos en el kit están libres de nucleasas contaminantes, lo que permite la síntesis de transcritos de ARN de alta calidad e intactos. El kit está diseñado para ofrecer alta estabilidad y flexibilidad, de modo que puede utilizarse para sintetizar ARNm, ARN marcado con colorantes, sondas radiomarcadas de alta actividad específica y ARN con caperuza. El manual del kit incluye una lista de protocolos específicos y materiales adicionales necesarios para cada una de estas aplicaciones. También contiene información técnica sobre el uso de productos de PCR y oligonucleótidos de ADN sintéticos como moldes para la transcripción. Es importante tener en cuenta que el kit de transcripción solo puede utilizar moldes de ADN que contengan un promotor T7.

El método descrito en este artículo demuestra la adición postranscripcional de la cofia en el ARN mediante la enzima de adición de cofia del virus vaccinia, así como la adición cotranscripcional de la cofia utilizando un análogo de la estructura de la cofia del ARN. Hemos demostrado que ambos métodos sintetizan ARN con cofia que es funcionalmente activo tras la transfección. La estructura de la cofia en el extremo 5' mejora la estabilidad del ARN y la eficiencia de traducción, y por lo tanto es importante para experimentos de microinyección11 y transfección7. El método de adición cotranscripcional de la cofia genera entre 40 y 50 μg de ARN con cofia en un ~80%. Es importante tener en cuenta que el uso del análogo de la cofia de ARN 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA), que está bloqueado en el grupo 3'-hidroxilo del m7G, garantiza la incorporación de la cofia en la orientación correcta17. Para añadir la cofia a cantidades mayores de ARN, es posible escalar las reacciones estándar de ambos métodos de adición de cofia. Sin embargo, el uso del Sistema de Adición de Cofia Vaccinia sería una opción más factible desde el punto de vista económico, ya que la adición cotranscripcional de la cofia utiliza un análogo de la cofia, componente relativamente costoso. El Sistema de Adición de Cofia Vaccinia también es un método superior, ya que presenta una eficiencia de adición de cofia de casi el 100 %.

Los métodos de capping de ARN descritos anteriormente sintetizan ARN con una estructura de cap 0 en el extremo 5'. La estructura de cap 1 implica una metilación adicional en la posición 2'-O del azúcar ribosa del primer nucleótido en el extremo 5' del ARN. Se ha informado que la estructura de cap 1 mejora la eficiencia de traducción del ARN18 y puede incorporarse mediante el uso de 2'-O-Metiltransferasa20,21.

El método descrito en este artículo puede utilizarse para transcribir, añadir la caperuza y transfectar cualquier ARNm deseado. Las luciferasas GLuc y CLuc se utilizaron específicamente en este protocolo debido a sus numerosas ventajas. Estas se secretan directamente al medio celular, evitando así la necesidad de lisis celular. Además, generan una intensidad de señal bioluminiscente alta, y los ensayos de actividad son altamente sensibles y fáciles de realizar. Es importante tener en cuenta que la expresión de GLuc en las células puede verse influenciada por diversos factores distintos de la funcionalidad del ARN en sí. Algunos ejemplos son errores en la pipetación, número variable de células por pocillo, eficiencia de transfección, etc. Se utiliza la normalización de datos para tener en cuenta estos factores. En nuestro protocolo, co-transfectamos ARN de CLuc como control interno junto con el ARN de GLuc. Cuando la luminiscencia de GLuc se divide por los valores de control de CLuc, se normaliza respecto a los errores y la variabilidad en la transfección19.

Divulgaciones

Todos los autores son empleados de New England Biolabs, Inc.

Agradecimientos

Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7New England BiolabsE2040S
3’-0-Me-m7G(5’)ppp(5’Estructura análoga del casquete de ARN New England BiolabsS1411S
DNasa I (libre de RNasa)New England BiolabsM0303S
Sistema de Capado de VacciniaNew England BiolabsM2080S
MEGAclear KitAmbionAM1908
NanoDrop EspectrofotómetroThermo Fisher Scientific, Inc.
Kit Agilent RNA 6000 NanoAgilent Technologies5067-1511
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA
TransKit de transfección de ARNm IT Mirus Bio LLCMIR2250
Medios líquidos clásicos HyClone*: Dulbecco’s Águila modificada’s Medio, Glucosa AltaThermo Fisher Scientific, Inc.SH30285.01
Aminoácidos no esenciales HyCloneThermo Fisher Scientific, Inc.SH30238.01
Centro LB 960 Berthold Technologies
BioLux Gaussia Kit de ensayo de luciferasaNew England BiolabsE3300S
BioLux Cypridina Kit de ensayo de luciferasaNew England BiolabsE3309S
Inhibidor de RNasa, murino New England BiolabsM0314
Inhibidor de RNasa, Placenta HumanaNew England BiolabsM0307
pCMV-GLuc Plásmido de controlNew England BiolabsN8081

Referencias

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