La devastación de los cultivos de cereales de semillas por los hongos que infectan ha llevado a los numerosos esfuerzos de investigación para comprender mejor las interacciones planta-patógeno. Para estudiar las interacciones entre las semillas de hongos en un entorno de laboratorio, hemos desarrollado un método robusto para la cuantificación de reproducción de los hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas mediante bioensayos del kernel.
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Artículo de método
La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo
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Resumen
Resumen
La descomposición de granos por semilla-hongos que infectan plantea uno de los mayores desafíos económicos a la producción de cereales en todo el mundo, por no hablar de los riesgos graves para la salud humana y animal. Entre la producción de cereales, el maíz es sin duda el cultivo más afectado, debido a patógenos inducida por pérdidas en la integridad del grano y la contaminación de las semillas de micotoxinas. Los dos micotoxinas más comunes y problemáticas de los productores de maíz y de alimentos y procesadores de alimentos son las aflatoxinas y las fumonisinas, producida por Aspergillus flavus y Fusarium verticillioides, respectivamente.
Recientes estudios moleculares de las interacciones planta-patógeno han demostrado promesa en la comprensión de los mecanismos específicos asociados con la respuesta de las plantas a la infección por hongos y la contaminación por micotoxinas 1,2,3,4,5,6. Debido a que muchos laboratorios están utilizando ensayos del núcleo para estudiar patógenos de plantas interacciones, existe una necesidad de un método normalizado para la cuantificación de diferentes parámetros biológicos, asíresultados de distintos laboratorios se puede interrogar a interpretar. Para un método eficaz y reproducible para el análisis cuantitativo de las semillas, se han desarrollado ensayos de laboratorio en el núcleo y los métodos siguientes para cuantificar el crecimiento de hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas. Cuatro esterilizados granos de maíz se inoculan en viales de vidrio con una suspensión fúngica (10 6) y se incubaron durante un período predeterminado. Viales de muestras se seleccionan entonces para la enumeración de los conidios por análisis de biomasa hemocitómetro, ergosterol basada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la cuantificación de aflatoxinas utilizando un método AflaTest fluorómetro, y cuantificación fumonisina por HPLC.
Protocolo
1. Bioensayo grano de maíz
- Dos semanas antes, la cultura de los hongos patógenos en Agar Papa Dextrosa (PDA) a 28 ° C.
- Seleccione granos con un tamaño y forma similar, preferentemente plana por lo que estaba a nivel con la parte inferior de los viales de bioensayo, y el lugar en 50 ml tubos Falcon. Granos seleccionados deben haber sido producidos simultáneamente en un mismo entorno para asegurarse de edad de la semilla o composición similar metabolito.
- Surface esterilizar núcleos agitando los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos con 70% de etanol, 1 minuto con agua estéril, y 10 minutos con hipoclorito de sodio al 6%. Enjuague....
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Discusión
Los métodos descritos aquí se ha probado extensamente y ha demostrado ser robusta en la generación de resultados cuantificables para la colonización por hongos, esporogenesis, y la producción de micotoxinas. Por otra parte, estos métodos deben ser aplicables a las semillas de otras especies de plantas que son susceptibles a la contaminación con hongos micotoxigénicos (por ejemplo, los cacahuetes, trigo, algodón, pistachos, etc.) Para competentes los análisis de interacción planta-patógeno, es imperativo que las semil.......
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Divulgaciones
No tengo nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Brandon Hassett y Carlos Ortiz por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la NSF subvenciones IOB-0544428, el IOS-0951272, 0925561 y IOS-con el Dr. Michael Kolomiets, y por el Instituto Nacional del USDA de Alimentos y Agricultura (NIFA), Mejoramiento Vegetal y AFRI Educación Grant # 2010-85117 -20539 a los Dres. Seth Murray, Isakeit Thomas y Michael Kolomiets.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Catálogo # | |
| Agar Patata Dextrosa | Fisher científico se | S71659A | |
| Tween-20 al | Fisher científico se | BP337-100 | |
| Recipiente de incubación de plástico | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Licuadora | Vicam | 20200 | |
| 24 cm filtro plegado documentos | Vicam | 31240 | |
| 1,5 m de microfibra de vidrio | Vicam | 31955 | |
| Afla columna de prueba | Vicam | G1024 | |
| Afrla prueba para desarrolladores | Vicam | 32010 | |
| El metanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitrilo | Fisher científico se | AC14952-0025 | |
| Etanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 | |
| C-18 de fase sólida columna de extracción (Prep septiembre Columna SPE C18) | Fisher científico se | 60108-304 | |
| O-ftalaldehído (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g | |
| El ácido bórico | Fisher científico se | BP168-500 | |
| Borato de sodio | Fisher científico se | RDCS0330500 | |
| Mercaptoetanol | Fisher científico se | 45-000-231 | |
| HPLC Shimadzu LC-20AT (bomba) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT | |
| Zorbax ODS columna (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl detector de fluorescencia | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL | |
| Fosfato sódico | Fisher científico se | AC38987-0010 | |
| FB1 normas | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg | |
| Cloroformo | VWR | MK444410 | |
| 13 mm de filtro jeringa con membrana de nylon 0,45 um (HPLC) | Pall Life Science | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Centelleo viales | VWR | 66021-602 | |
| Cloruro de Sodio | Vicam | G1124 |
Referencias
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M.
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Reimpresiones y permisos
