Recientemente alto rendimiento de la tecnología de secuenciación ha aumentado considerablemente la sensibilidad de la cromatina immunoprecipitation (CHIP) y el experimento se le solicite su aplicación con células purificadas o tejidos disecados. Aquí delinear un método para usar la técnica con el chip Drosophila Tejido, que puede abordar el estado de la cromatina endógena en un sistema bien caracterizado biológica.
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Artículo de método
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), utilizando Drosophila Tejido
En este artículo
Resumen
Resumen
Epigenética sigue siendo un campo de rápido desarrollo que estudia cómo el estado de la cromatina contribuye a la expresión diferencial de genes en distintos tipos de células en diferentes etapas de desarrollo. La regulación epigenética contribuye a un amplio espectro de procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular durante el desarrollo embrionario y la homeostasis en la edad adulta. Una estrategia de crítica en los estudios epigenéticos es examinar cómo diferentes modificaciones de las histonas y los factores de la cromatina regula la expresión génica. Para abordar esta, inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza ampliamente para obtener una instantánea de la asociación de factores particulares con el ADN en las células de interés.
Técnica chip comúnmente utiliza células cultivadas como material de partida, que puede obtenerse en abundancia y homogeneidad para generar datos reproducibles. Sin embargo, hay varias advertencias: En primer lugar, el medio para hacer crecer células en placas de Petri es diferente de la que in vivo, por lo tanto puedeno reflejan el estado de la cromatina endógena de las células en un organismo vivo. En segundo lugar, no todos los tipos de células pueden ser cultivadas ex vivo. Hay sólo un número limitado de líneas celulares, de los cuales la gente puede obtener suficiente material para chip de ensayo.
Aquí se describe un método para hacer experimentos chip usando tejidos de Drosophila. El material de partida se disecciona tejido de un animal vivo, con lo que puede reflejar con precisión el estado de la cromatina endógeno. La capacidad de adaptación de este método con muchos tipos diferentes de tejidos permitirá a los investigadores para hacer frente a una gran cantidad biológicamente más preguntas relevantes con respecto a la regulación epigenética en vivo 1 y 2. La combinación de este método con secuenciación de alto rendimiento (chip-ss) también permitirá a los investigadores para obtener un panorama epigenómico.
Protocolo
(El procedimiento completo dura chip aproximadamente dos días. Preparación de las bibliotecas de chip para la secuenciación de alto rendimiento requiere unos 2-3 días).
1. Disecar y preparar el tejido para el Experimento chip (aproximadamente 1 millón de células)
- Disecar el tejido de interés (por ejemplo, 200 pares de Drosophila testículos) en PBS frío inhibidor de la proteasa + 1x (disolver una pastilla de cóctel de inhibidores de la proteasa en 1,5 ml de PBS 1x para obtener la solución stock de 7x) + PMSF (concentración final de 100 mg / mL). Lavar dos veces tejido y resuspender el tejido en 200 l de....
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Discusión
La versatilidad de los análisis de chip discutidos en este protocolo se puede utilizar en diferentes tejidos, lo que proporciona una oportunidad para estudiar el estado de la cromatina en un sistema biológicamente relevantes. Experimentos chip usando células cultivadas procedentes de sistemas son convenientes para llevar a cabo porque gran cantidad de células se pueden obtener fácilmente. Sin embargo, las células cultivadas no reflejan necesariamente las células en un entorno multi-celular. Mediante el desarrollo de est.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el laboratorio del Dr. Zhao Keji (NIH / NHLBI) por su ayuda en la provisión de resultados de la secuenciación. También nos gustaría dar las gracias al proyecto del genoma UCSC para el uso de Genoma del navegador para visualizar la secuencia asignada lee.
Este trabajo ha sido financiado por el Camino R00HD055052 NIH para el Premio de la Independencia y R01HD065816 de NICHD, la Fundación Lucile Parkard, y la Universidad Johns Hopkins, la puesta en marcha fondos para XC
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Completa el cóctel de inhibidores de la proteasa del Mini | Roche | 11836153001 | |
| El formaldehído (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellets maja | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR kit de purificación de | Qiagen | 28104 | |
| Poliacrilamida lineal | Sigma | 56575-1ML | |
| El glucógeno | Qiagen | 158930 | |
| SYBR verde / ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini placa de control de giro | Labnet | Z723533 | |
| PCR en tiempo real del sistema | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Procesador de ultrasonidos pequeño volumen | Misonix | HS-XL2000 | Modelo descontinuado |
| Dynabeads, Proteína A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag imán | Invitrogen | 123-21D | |
| Fenol: Chlorofrom: AIA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentro final del ADN kit de reparación | Epicentro Biotecnologías | ER0720 | |
| MinElute Reaction equipo de limpieza | Qiagen | 28204 | |
| Fragmento de Klenow (3 '→ 5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| ADN ligasa de T4 | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptador de oligonucleótidos | Illumina | PE-400-1001 | |
| Vinculados Primer Fin de 1,0 y 2,0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis sistema | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
Referencias
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B.
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Reimpresiones y permisos
