El objetivo general de este video es mostrar cómo llevar a cabo la inyección específica de retina y In ovo Electroporación de ADN / ARN construcciones en la retina de embriones de pollo en el Hamburger y la etapa de Hamilton 22-23, que es aproximadamente el día embrionario 4 (E4). Esta técnica es muy útil para estudiar la expresión génica, la regulación de genes, y el cambio morfológico en el desarrollo de retina de pollo.
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Artículo de método
En electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo
En este artículo
Resumen
Resumen
La retina embrionaria de pollo es una excelente herramienta para estudiar el desarrollo de la retina en los vertebrados superiores. Debido al enorme tamaño y desarrollo externo, es comparativamente muy fácil de manipular la retina de embriones de pollo con ADN recombinante / tecnología de ARN. La electroporación de ADN / ARN construcciones dentro de la retina embrionaria tienen una gran ventaja para estudiar la regulación de genes en la retina células madre / progenitoras durante el desarrollo de la retina. Diferentes tipos de ensayos tales como la prueba del gen, la sobre-expresión del gen, el gen tumbar (shRNA), etc se puede realizar utilizando la técnica de electroporación. Este video muestra la inyección dirigida la retina y en la electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo en el Hamburger y Hamilton etapa de 22-23, que es aproximadamente el día embrionario 4 (E4). Aquí nos muestran un rápido y conveniente en la técnica de electroporación in ovo por el cual un plásmido de ADN que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador se entregarán directamente en elde embriones de pollo subretiniano espacio y seguido por pulsos eléctricos para facilitar la absorción de ADN por la retina células madre / progenitoras. El nuevo método de inyección de retina y la electroporación en E4 permite la visualización de todos los tipos de células retinales, incluyendo la neuronas tarde-nacido en 1, que ha sido difícil con el método convencional de inyección y la electroporación en E1.5 2.
Protocolo
Dado que algunas partes del protocolo se realizó tal como se ha descrito previamente en otros vídeos JOVE 2 y 3 papeles con modificación menor no vamos a discutir aquellos en detalle aquí.
1. Manejo de los huevos y preparación de la aguja
- Los huevos pueden ser almacenados en un enfriador de vino menos aproximadamente 13 ° C hasta por 1 semana. Si la temperatura es demasiado alta, los embriones comienzan a desarrollarse anormalmente, mientras que una temperatura más baja provoca una alta mortalidad. Una vez que esté listo para incubar sacar los huevos del refrigerador para vinos y establecer los huevos en p....
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Discusión
Dirigida por inyección en la retina y la electroporación in ovo en la retina de embrión en la etapa E4 pueden dirigirse específicamente a las células retinianas progenitoras derivadas de la capacidad de visualizar todos los seis tipos principales de células de retina en el nivel de células individuales. En la electroporación in ovo en HH10 (~ E1.5) centradas en la vesícula óptica es capaz de transfectar células que se desarrollan para formar el ojo. Sin embargo, estas células tienen u.......
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Divulgaciones
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el animal de Atención Institucional y el Comité de Servicios de la Universidad Rutgers.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias al Sr. Enver Maaz para el uso de su cámara de alta definición (Cannon VIXIA HFS100). Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH (EY018738), Nueva Jersey Comisión de Investigación de la Médula Espinal (08-3074-SCR-E-0 y 10-3091-SCR-0-E), y Busch Premio de Investigación Biomédica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Fertilizados libres de patógenos (SPF) White Leghorn huevos de gallina | Granjas de Sunrise (Catskill, Nueva York) | ||
| Incubadora de huevo de gallina | MAC es la fabricación, Savannah, GA | Modelo-1550 | Se establece en 60% de humedad y 37.5 ° C. |
| Vidrio capilares tubos | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0,1 ml jeringa | Hamilton Co. Reno, Nevada | Estanca entre 1710 | Alternativamente jeringa 1ml puede ser utilizado como así |
| Masterflex de silicona (peróxido) Tubería | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Corte un pedazo pequeño (1 cm) para fijar la aguja de cristal a la jeringa |
| Pinzas | Dumont | AA | |
| Micromanipulador | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| El ADN del plásmido | pCAG-GFP fue tomado de la Dra. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Diluir a 0,025% con PBS |
| Generador de impulsos | Aparato de Harvard, MA | BTX ECM 830 | Generador de onda cuadrada |
| Electrodos | Aparato de Harvard, MA | BTX Modelo 514 | Nuestros electrodos estaban separados 3-5 mm de distancia |
| Cámara digital blanco y negro | Zeiss, Alemania | Axiocam MRM | |
| Microscopio de disección fluorescente | Leica Microsystems, Alemania | Leica MZ16FA | |
| Microscopio de fluorescencia vertical | Zeiss, Alemania | Zeiss Axio Imager A1 |
Referencias
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Emb....
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Reimpresiones y permisos
