El ensayo de colesterol está diseñado para cuantificar la tasa de eflujo de colesterol a partir de células cultivadas y la capacidad de plasma aceptores para aceptar el colesterol liberado de las células. El ensayo consiste en el etiquetado de las células con el colesterol, equilibración de colesterol entre piscinas intracelulares y la liberación de colesterol a un aceptor extracelular.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Ensayo de eflujo de colesterol
En este artículo
Resumen
Resumen
El contenido de colesterol de las células deben mantenerse dentro de los límites muy estrechos, demasiado o demasiado poco de colesterol en unos resultados de células en la interrupción de las membranas celulares, la apoptosis y necrosis 1. Las células pueden colesterol fuente de la síntesis intracelular y de las lipoproteínas del plasma, ambas fuentes son suficientes para satisfacer plenamente las necesidades de células para el colesterol. Los procesos de la síntesis de colesterol y el consumo están fuertemente regulados y las deficiencias de colesterol son poco frecuentes 2. El exceso de colesterol es de 3 problema más común. Con la excepción de los hepatocitos y algunas células adrenocorticales grado, las células son incapaces de degradar el colesterol. Las células tienen dos opciones para reducir su contenido de colesterol: para convertir el colesterol en ésteres de colesterol, una opción con una capacidad limitada, como la sobrecarga de las células con ésteres de colesterol también es tóxico, y el eflujo de colesterol, una opción con la capacidad potencialmente ilimitada. Eflujo de colesterol es una especificaciónproceso de IFIC que está regulada por una serie de transportadores intracelulares, como el ATP vinculante cassette transportista proteínas A1 (ABCA1) y G1 (ABCG1) y B1 del receptor scavenger tipo. El aceptador natural de colesterol en plasma es de lipoproteína de alta densidad (HDL) y apolipoproteína AI.
El ensayo de eflujo de colesterol está diseñado para cuantificar la tasa de eflujo de colesterol a partir de células cultivadas. Se mide la capacidad de las células para mantener el eflujo de colesterol y / o la capacidad de plasma aceptores para aceptar el colesterol liberado de las células. El ensayo consiste en los pasos siguientes. Paso 1: etiquetado colesterol celular mediante la adición de colesterol marcado a medio que contenía suero e incubando con células durante 24-48 h. Este paso puede ser combinado con la carga de las células con el colesterol. Paso 2: incubación de las células en medio libre de suero que se equilibre el colesterol marcado entre todos los grupos de colesterol intracelular. Esta etapa puede ser combinado con la activación de celular CHtransportistas olesterol. Paso 3: incubación de las células con aceptor extracelular y cuantificación de movimiento de colesterol marcado de las células al aceptor. Si los precursores de colesterol se utiliza para etiquetar el colesterol recién sintetizado, un cuarto paso, la purificación de colesterol, puede ser requerido.
El ensayo proporciona la siguiente información: (i) cómo un tratamiento particular (una mutación, un derribo, la sobreexpresión de una o de un tratamiento) afecta a la capacidad de las células con el colesterol flujo de salida y (ii) cómo la capacidad de los aceptantes de plasma para aceptar el colesterol se ve afectada por una enfermedad o un tratamiento. Este método se utiliza a menudo en el contexto de la investigación cardiovascular, enfermedades metabólicas y neurodegenerativas, infecciosas y enfermedades reproductivas.
Protocolo
1. Preparación de [3 H]-colesterol
- En la campana de humos, dispensar la cantidad necesaria de colesterol [3 H] en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (0,5 Ci (19 kBq) por pocillo se requiere para un ensayo típico).
- Si [3 H]-colesterol se suspendió en tolueno, que se seque por completo con gas N2 y resuspender con 100% de etanol a una concentración final de 1 Ci (37 kBq / l. Vortex y se mezcla bien.
2. Células en placas y al etiquetado de colesterol celular
Este protocolo ha sido probado con los siguientes tipos de células: monocitos humanos 4,5,
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El método descrito para medir el eflujo de colesterol está diseñado para medir el movimiento de colesterol de las células a un aceptor de colesterol extracelular. Hay varias consideraciones importantes en la comprensión de esta metodología.
Etiquetado y el equilibrio
En la metodología descrita colesterol marcado se añadieron al suero que contiene suero. Aunque nunca investigado en detalle, se supone que el colesterol se incorpora en las lipoproteínas de suero y que .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses relacionados con este estudio.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de Nacional de Salud y el Consejo de Investigación Médica de Australia (NHMRC) (526.615 y 545.906) y en parte por el Programa del Gobierno de Victoria OIS. DS es un compañero de NHMRC.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Reactivos \ células | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Medios completos | RPMI - 10% de FCS - 1% de L-glutamina - Pen 0,2% por estreptococos | M199 - 5% de FCS - 1% de L-glutamina - Pluma de 1% por estreptococos - HEPES al 2% (1M) - 7% de las células endoteliales suplemento de crecimiento (ECG) | DMEM - 10% de FCS - 1% de L-glutamina - Pen 0,2% por estreptococos | |||
| Medio libre de suero | RPMI - 1% de L-glutamina - Pen 0,2% por estreptococos | M199 - 1% de L-glutamina - Pluma de 1% por estreptococos - HEPES al 2% (1M) - 7% de células endoteliales crecenº suplemento (ECG) | DMEM - 1% de L-glutamina - Pen 0,2% por estreptococos | |||
| Paso Método | 1 x Tripsina | Suspensión | Raspar | 1 x Tripsina | ||
| Paso Relación | 03:10 | 01:03 | 01:20 | 01:03 | 01:03 | |
| Activación de las células (opcional) | A-901317 - LXR-agonista - Concentrado final. 4 micras, | |||||
| Otros reactivos | forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) - Diferenciación celular - Concentrado final. 0.1μg/ml | |||||
Referencias
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
