Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) para la selección de alto rendimiento antifúngico

Resumen

Hemos desarrollado una plataforma de microarrays de alta densidad que consiste en 3D nano-biopelículas de C. albicans Llamada Ca BChip. El perfil de susceptibilidad de medicamentos probados en una Ca BChip es comparable a la del modelo convencional de la placa de 96 pozos, lo que sugiere que el chip de hongos es ideal para una verdadera selección de alto rendimiento de los fármacos antimicóticos.

Resumen

Candida albicans sigue siendo el principal agente etiológico de la candidiasis, que actualmente representa la infección nosocomial cuarto torrente sanguíneo más común en los hospitales de Estados Unidos ^1. Estas infecciones oportunistas constituyen una amenaza creciente de un número creciente de individuos comprometidos, y llevar a las tasas de mortalidad inaceptablemente alta. Esto es en parte debido al arsenal limitado de fármacos antifúngicos, sino también a la aparición de resistencia contra los agentes más comúnmente utilizados antifúngicos. Para complicar más el tratamiento es el hecho de que una mayoría de las manifestaciones de la candidiasis están asociados con la formación de biopelículas, y dentro de estas células biopelículas muestran mayores niveles de resistencia a la mayoría clínicamente utilizados agentes antifúngicos ^2. Aquí se describe el desarrollo de una micromatriz de alta densidad que consiste de C. albicans nano-biopelículas, que hemos denominado Ca BChip ^3. En pocas palabras, un microarrayer robótica se utiliza to las células de levadura de impresión de C. albicans sobre un sustrato sólido. Durante la impresión, las células de levadura están encerrados en una matriz tridimensional utilizando un volumen tan bajo como 50 nL y inmovilizado sobre un sustrato de vidrio con un recubrimiento adecuado. Después de la impresión inicial, los portaobjetos se incubaron a 37 ° C durante 24 horas para permitir el desarrollo del biofilm. Durante este período, los puntos se convierten en la plena madurez "nano-biofilms" que muestran las características típicas estructurales y fenotípicos asociados con la madurez C. albicans biopelículas (es decir, la complejidad morfológica, tres dimensiones y la arquitectura de resistencia a los medicamentos) ^4. En general, el BChip Ca está compuesto de ~ 750 biopelículas equivalentes y distinta espacialmente, con la ventaja adicional de que múltiples chips se pueden imprimir y procesan simultáneamente. La viabilidad celular se calcula midiendo la intensidad de fluorescencia de Fun1 metabólica mancha utilizando un escáner de microarrays. Este chip de hongos es ideal para la Use en verdad cribado de alto rendimiento para el descubrimiento de fármacos antifúngicos. En comparación con los estándares actuales (es decir, el modelo de microtitulación de 96 pocillos de la formación de biopelículas ^5), las principales ventajas del chip biopelícula hongos son automatización, miniaturización, el ahorro en la cantidad y el coste de los reactivos y el tiempo de análisis, así como la eliminación del trabajo pasos intensivos. Creemos que el chip de tal forma significativa a acelerar el proceso de descubrimiento de fármacos antifúngicos.

Protocolo

1. Preparación de las diapositivas funcionalizados

1. Coloque los portaobjetos en un bastidor deslizante extraíble, y lavar dos veces por inmersión en una cubeta que contiene 99% de etanol (grado histológico). Limpie las diapositivas limpiar con toallas de papel (para asegurar que no genere polvo de papel), y seca con un chorro de gas nitrógeno comprimido.

NOTA: No utilice paños de Kim-para eliminar las diapositivas, ya que podría generar el polvo de papel fino.

2. Sumerja la parrilla corrediza que contiene las diapositivas en una cubeta llena de ácido sulfúrico concentrado y se incuban a....

Discusión

Hemos desarrollado una base de células de alta densidad de microarrays, Ca BChip, que consta de los volúmenes de nanolitros de Candida albicans biopelículas. El microarray fue impreso en el vidrio modificado sustratos, lo que permitió para la fijación sólida de los puntos de gel de colágeno mientras que proporciona hidrofobicidad necesaria para la no propagación de gel 3D hemisférica. Una sola BChip Ca puede reemplazar aproximadamente ocho placas de 96 pocillos, y varios chips se pueden imprim.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
3-aminopropiltrietoxisilano (APTES)	Sigma-Aldrich	440140
Poliestireno-co-anhídrido maleico (PS-MA)	Sigma-Aldrich	426946
Portaobjetos de vidrio de microscopía	Fisher Scientific	12-549-3
Cola de Rata colágeno tipo I	BD Biosciences	354236
Robótica Microarrayer	Omnigrid Micro	MICROSYS4000/4100A
Microarray Scanner	Genepix personal 4100A	GENEPIX4100A
La hibridación de cassette	Arrayit Corporación	AHCXD
Fun1 [2-cloruroRO-4-(2,3-dihidro-3-metil-(benzo -1,3-tiazol-2-il)-metiliden)-1-fenil quinoliniumiodide]	Invitrogen Corp.	F-7030
Fluconazol	Sicor Pharmaceuticals, Inc.	J02AC01
La anfotericina B	Sigma	A2411
RPMI-1640	Mediatech, Inc.	50 a 020-PC
Consejo de cerámica 190 m del orificio	Digilab	60020441-00
GraphPad Software Prism	GraphPad Software, Inc.
GenePix Pro V4.1	Molecular Devices