Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Resumen

Microscopía multifotónica de órganos enteros de ratón es posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes, pero no todos los protocolos de preservar la señal fluorescente de proteínas fluorescentes. El uso de un método de compensación óptica con base de etanol y alcohol bencílico deshidratación: bencil benzoato de compensación, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de cerebro de ratón que expresa toda YFP.

Resumen

Microscopía multifotónica de generación armónica fluorescencia intrínseca y segundo (SHG) de órganos enteros de ratón se hace posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes. ^{1,2 Sin} embargo, para los órganos que contienen las proteínas fluorescentes como GFP y YFP, protocolos ópticos de compensación que utilizan metanol deshidratación y clara usando bencil alcohol: benzoato de bencilo (BABB), mientras que no protegido de la luz ³ no preservan la señal fluorescente. El protocolo presentado aquí es una forma novedosa en la que realizar todo el órgano de compensación óptica en cerebro de ratón preservando al mismo tiempo la señal de fluorescencia de YFP expresan en las neuronas. Alterar el protocolo de intercambio de información óptica de tal manera que el órgano se deshidrata mediante una serie de etanol se ha encontrado para reducir el daño a las proteínas fluorescentes y preservar su señal fluorescente para formación de imágenes multifotónica. ⁴ Usando un método optimizado de compensación óptica con base de etanol y deshidratación cobro por parte BABBmientras protegida de la luz, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de proteína amarilla fluorescente (YFP) de expresión en las neuronas del cerebro de un ratón de más de 2 mm por debajo de la superficie del tejido.

Protocolo

1. Animal perfusión ⁵ y Compensación Total de cerebro de ratón

1. La longitud total del procedimiento pueden variar dependiendo de la duración de tiempo utilizado por cada etapa de deshidratación, pero en total todo el proceso puede llevarse a cabo en dos días.
2. Pesar ratones YFP y luego profundamente anestesiar con una inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg).
3. Confirmar un plano quirúrgico de anestesia profunda antes de proceder a la cirugía. Entrada del animal cada 5 min para ver si reacciona a un dedo del pie firme o de pinzamiento del rabo. Si el animal reacciona, una dosis suplementaria (1/3....

Discusión

Mientras estándar colorantes orgánicos son compatibles con una amplia gama de disolventes orgánicos, y por lo tanto no suponen un reto particular para la limpieza de los protocolos, las proteínas fluorescentes a menudo son menos tolerantes a los cambios en el disolvente. ⁴ El objetivo del presente trabajo fue superar una limitación seria de anteriores protocolos de compensación óptica donde se perdió la fluorescencia de XFPs o gravemente degradada. Las imágenes que se presentan demuestran que la fluorescencia.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	El número de catálogo	Comentarios
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, Inc.	D8537	500 ml, pH 7,2
Paraformaldehído	Microscopía Electrónica de Ciencias	15710	10 x 10 ml, paraformaldehído al 16%
Alcohol de etilo	Americana Bioanalytical	AB00515-00500	500 ml, 200 pruebas
Alcohol de etilo	Productos Pharmco, Inc.	111000190	1 gal., 190 pruebas
Alcohol bencílico	Sigma-Aldrich, Inc.	402834	500 ml, 99 +%
Benzoato de bencilo	Sigma-Aldrich, Inc.	B6630-IL	500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objetivo	Nikon	AZ Harina Plan de 5X	15 WD