Demostración de un ensayo cuantitativo rápido de la inhibición de la coagulación de la sangre por el bajo peso molecular de la heparina, enoxaparina. La contribución de la enoxaparina se evalúa mediante la eliminación de su influencia a través de la digestión con heparinasa. Una descripción más completa de la prueba se detalla en nuestro artículo publicado. 1 El ensayo aún requiere la confirmación clínica.
Artículo de método
Rapid Point-of-Care Ensayo de la eficacia anticoagulante enoxaparina en sangre entera
En este artículo
Resumen
Resumen
Existe la necesidad de un ensayo clínico para determinar la medida en que es efectivamente la sangre de un paciente anticoagulada por el bajo peso molecular de la heparina (HBPM), enoxaparina. Hay también urgentes situaciones clínicas en las que sería importante si esto podría ser determinada rápidamente. El presente ensayo está diseñado para lograr esto. Sólo se ensayaron muestras de sangre humana que fueron inoculadas con concentraciones conocidas de enoxaparina. La característica esencial del presente ensayo es la cuantificación de la eficacia de la enoxaparina en la muestra de sangre de un paciente mediante la degradación de que se complete la inactividad con heparinasa. Dos muestras de sangre fueron extraídas en tubos Vacutainer (Becton Dickenson-; Franklin Lakes, NJ) que se cargaron con enoxaparina; una muestra se digirió con heparinasa durante 5 min a 37 ° C, la otra muestra representada estado basal del paciente anticoagulada. El porcentaje de acortamiento del tiempo de coagulación en la muestra tratada con heparinasa, en comparación con la bestado aseline, cedió la contribución anticoagulante de la enoxaparina. Se utilizó el portátil, funciona con baterías Hemochron aparato 801 para la medición de los tiempos de coagulación (International Technidyne Corp., Edison, NJ). El aparato dispone de 2 termostáticas (37 ° C) pozos de tubo de ensayo. Hemos llevado a cabo ensayos en dos tipos de cartuchos de ensayo que están disponibles desde el fabricante del instrumento. Un cartucho se modificó para aumentar su sensibilidad. Hemos eliminado el caolín del cartucho FTK-ACT por extenso lavado con agua destilada, dejando sólo la superficie de vidrio del tubo, y tal vez el imán de detección, como activadores. Llamamos a este ensayo mínimamente activa nuestra (MAA). El uso de un ensayo mínimamente activa ha sido estudiado por nosotros y otros. 2-4 El segundo cartucho que se estudió era un tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) (A104). Esto fue usado tal como se suministra por el fabricante. Los pozos termostatados del instrumento were utiliza tanto para la digestión con heparinasa y ensayos de coagulación. El ensayo puede ser completada dentro de 10 min. El ensayo MAA mostró cambios robustos en tiempo de coagulación después de la digestión con heparinasa de la enoxaparina sobre un rango de concentración clínica típica. A 0,2 UI anti-Xa de la enoxaparina por ml de muestra de sangre, la digestión con heparinasa causado una disminución media del 9,8% (20,4 seg) en el tiempo de coagulación; menos 1,0 UI por ml de enoxaparina hubo una disminución del 41,4% (148,8 seg). Este informe sólo presenta la aplicación experimental del ensayo; su valor en un entorno clínico todavía debe ser establecido.
Protocolo
1. Heparinasa Reconstitución
- Liofilizado I heparinasa se obtiene comercialmente (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) en viales que contienen 1 g de la proteína purificada. La proteína se disolvió en 0,25 ml de solución salina (0,9% NaCl).
2. Toma de muestras de sangre
- Dos muestras de sangre por vacío en citrato de sodio (0,3 ml 0,109 M; 3,2%) tamponada tubos Vacutainer (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ); los tubos son ambos pre-claveteado con una concentración conocida de enoxaparina; el volumen de sangre que se dibuja es de 2,7 ml. El contenido total es entonces 3,0 ml.
3. Heparinasa Digestión
- El contenido completo del vial de la heparinasa que puede ser aspirado en una jeringa (aproximadamente 0,2 ml; 80% del vial; 0,8 g de proteína), se transfiere al tubo Vacutainer uno; 0,2 ml de solución salina (0,9% NaCl) se añade a el segundo tubo, que sirve como el Basileaine estado antes de la eliminación del efecto de la enoxaparina.
- Ambos tubos Vacutainer se colocan en los pocillos termostatizado del aparato Hemochron durante un período de 5 min. (La adecuación de un tiempo de digestión 5 minutos con heparinasa se estableció en nuestro trabajo previamente publicado. 1)
4. Ensayos de coagulación
- Al final de la incubación heparinasa, 2,0 ml de sangre se transfiere al cartucho de ensayo. En el caso del tubo de MAA, es pre-llenado con 0,1 ml de CaCl $ 250 2 mM para iniciar la coagulación. El ensayo aPTT comercial cartucho (A104) está diseñado para iniciar la coagulación en sangre total, que se ha elaborado en tubos vacutainer que contenían citrato de sodio como anticoagulante.
- El aparato Hemochron indica la finalización de la coagulación sanguínea y preserva los tiempos de coagulación en segundos. La diferencia en los tiempos de coagulación entre la muestra tratada con heparinasa y la muestra de referencia, dividido por la coagulación de time para la muestra de referencia, se obtiene el porcentaje de disminución resultante de la eliminación de la enoxaparina. Como se discute abajo, fuertes correlaciones lineales se han obtenido para la relación entre el porcentaje de disminución en el tiempo de coagulación y la concentración de la enoxaparina en muestras enriquecidas de sangre entera, así como para la correlación con las concentraciones medidas de enoxaparina por el ensayo chromgenic de anti-Xa actividad. Anti-Xa ensayos de concentración de enoxaparina se llevaron a cabo con un kit comercial para un ensayo cromogénico de dos etapas (BIOPHEN; Aniara, Mason, OH).
Resultados
La Figura 1 presenta los resultados para las relaciones entre el porcentaje de disminución en el tiempo de coagulación después de la eliminación de la enoxaparina con heparinasa de una serie de concentraciones con púas de enoxaparina (0,2, 0,4 y 1,0 anti-Xa UI por ml). Los resultados se presentan tanto para el MAA y cartuchos de ensayo aPTT. Las concentraciones medidas de enoxaparina de ensayo cromogénico de actividad anti-Xa se incluyen también en la abscisa de cada parcela.
La Figura 2 presenta los gráficos de los mismos datos que por ciento de disminución en el tiempo de coagulación frente a medida cromogénico de actividad anti-Xa.
Fuertes correlaciones lineales, con altas significancias estadísticas, se encontraron resultados para los cuatro relaciones.
Figura 1. Punto de determinaciones de atención de la enoxaparina contribution a tiempos de coagulación de sangre entera con púas basado en el porcentaje de cambio (acortamiento) de tiempo de coagulación después de la incubación con heparinasa. Las concentraciones de enoxaparina púas añadido a la sangre entera y los medidos de anti-Xa concentraciones en plasma (media ± SE, en paréntesis) se colocan en el eje de abscisas de cada gráfica. Todos los porcentajes de cambio en los tiempos de coagulación se presentan como medias y SE, junto con el acortamiento del tiempo de coagulación promedio en segundos. Los datos del mismo paciente están conectados por líneas de trazos. Los datos para los cuatro pacientes identificados con un asterisco en la parcela A son (resultados MAA) lo mismo que los cuatro pacientes en parcela B (ensayos APTT). Todos los resultados representan determinaciones individuales. Los coeficientes de correlación de Pearson fue de r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) y r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) para las relaciones con el MAA y aPTTassay, respectivamente. Reproducido con el permiso de Inchiosa et al. 1
. Figura 2 Los resultados de los porcentajes de cambio en los tiempos de coagulación en los ensayos de punto de cuidado que se muestran en las Figuras 1A y B se representan frente a plasma anti-factor Xa A concentraciones resultados MAA,;. B, ensayos de aPTT. Todos los resultados son de un solo ensayos de tiempo de coagulación y un único análisis de anti-factor Xa concentraciones. Los coeficientes de correlación de Pearson fue de r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) y r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) para las relaciones con el MAA y el ensayo de APTT, respectivamente Reproducido con permiso de Inchiosa et al. 1
Discusión
Este ensayo de eficacia de enoxaparina puede servir como una opción importante para determinar la seguridad relativa de la realización de un procedimiento invasivo que tiene un riesgo asociado de hemorragia o el desarrollo de un hematoma. Esto sería de particular importancia cuando una inyección epidural se está considerando. La mayoría de las guías recomiendan un período de espera de 12 horas entre la inyección de enoxaparina y la iniciación de un procedimiento invasivo 5 Insuficiencia renal, la obesidad y el embarazo puede influir en los requisitos de dosificación de enoxaparina 6,7 Dado que el ensayo puede ser completado en un 10.. - min período, también podría ser usado en una clínica o consulta del médico, en el que proporcionaría información sobre la adecuación de la anticoagulación en pacientes que están en un riesgo de desarrollo de tromboembolismo venoso. Ajustes inmediatos de dosis podría ser instituido, según sea necesario.
La concentración de la enoxaparina en el plasma se puede medir por un cromogénico unssay de la extensión de la inhibición del factor de coagulación, Xa. Sin embargo, esto sólo da su concentración no, específicamente su eficacia anticoagulante, que varía ampliamente entre los pacientes individuales. 6-8
Nuestros estudios se llevaron a cabo sólo con enoxaparina. Sin embargo, se puede anticipar que el ensayo se podría aplicar a cualquier HBPM que se degrada por la heparinasa I. Esto ya es conocido por ser el caso para la dalteparina, nadroparina y tinzaparina. 9-11 Se diseñó el ensayo en relación con las características de el instrumento Hemochron tiempo de coagulación. El instrumento es relativamente barato, también, los tubos de recogida de sangre desechables, heparinasa ampollas y cartuchos de ensayo para realizar un análisis para un paciente es de aproximadamente 15 dólares. Por lo tanto, se espera que sea adecuado para controlar el estado anticoagulante en diversos escenarios clínicos.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Las investigaciones se llevaron a cabo únicamente con el apoyo de los recursos departamentales e institucionales. El aparato de la coagulación (Hemochron 801) fue cedido sin compromiso por el fabricante. Los cartuchos de ensayo fueron adquiridos en sus costos de venta. La cifra de introducción en el video fue modificado a partir de Sanderink, et al. 12 La segunda figura en el vídeo (digestión heparinasa evolución en el tiempo) se reprodujo con permiso de Inchiosa et al. 1
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Hepzyme | Siemens | B4240 | heparinasa I |
| "MAA" cartucho | Technidyne | FTK-ACT | modificada por la eliminación caolín |
| TTPa cartucho | Technidyne | A104 |
Referencias
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39(2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10(2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
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