Un sistema de cultivo celular giratorio que permite a las células epiteliales de crecer bajo condiciones fisiológicas resultantes en 3-D formación de agregados celulares se describe. Los agregados generado pantalla En vivo Características similares no se observó en los modelos de cultivo convencionales y servir como un sistema modelo más exacto organotípico para una multitud de investigaciones científicas.
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Artículo de método
El cultivo y aplicaciones de la Rotación de biorreactor de pared de los vasos Derivado de modelos 3D de las células epiteliales
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células y los tejidos del cuerpo en las condiciones ambientales que influyen en la experiencia de su arquitectura, las comunicaciones intercelulares y funciones generales. Para los modelos in vitro de cultivos celulares para simular con precisión el tejido de interés, el entorno de crecimiento de la cultura es un aspecto crítico a considerar. Comúnmente se utilizan sistemas convencionales de cultivo de células se propagan en las células epiteliales planas superficies impermeables de dos dimensiones (2-D). Aunque mucho se ha aprendido de los sistemas convencionales de cultivo de células, los resultados de muchos que no son reproducibles en los ensayos clínicos humanos o explantes de tejido, potencialmente como resultado de la falta de un microambiente fisiológicamente relevantes.
A continuación, describimos un sistema de cultivo que supera muchas de las fronteras culturales de la condición 2-D de cultivos celulares, utilizando el innovador giro de la pared vascular (RWV) la tecnología de biorreactor. Nosotros y otros han demostrado que organotípicos RWV derivados de los modelos se pueden recapitular estruce, la función y auténticas respuestas humanas a los estímulos externos de manera similar a los tejidos de explantes humanos 1-6. El biorreactor RWV es un sistema de cultivo en suspensión que permite el crecimiento de células epiteliales en condiciones de baja fisiológicos de fluido de corte. Los biorreactores vienen en dos formatos diferentes, un buque de alta aspecto giratorio (HARV) o un buque lento giro lateral (STLV), en el que se diferencian por su fuente de aireación. Las células epiteliales se añaden al biorreactor de elección en combinación con los granos porosos, microportadoras revestidas por colágeno (Figura 1A). Las células utilizan las perlas como un andamio crecimiento durante la caída libre constante en el biorreactor (Figura 1B). El microambiente proporcionado por el biorreactor permite que las células para formar agregados tridimensionales (3-D) muestran in vivo características similares a menudo no se observa bajo estándar 2-D condiciones de cultivo (Figura 1D). Estas características incluyen uniones estrechas, MUCnos de producción, apical / basal de orientación, en la localización de la proteína in vivo, y otros tipo de células epiteliales de las propiedades específicas.
La progresión de una monocapa de células epiteliales a una totalmente diferenciados en 3-D agregada varía según el tipo de célula 1, 7-13. Muestreo periódico del biorreactor permite la monitorización de la formación epitelial agregado, los marcadores de diferenciación celular y la viabilidad (Figura 1D). Una vez que la diferenciación celular y la formación de agregados se ha establecido, las células se recogen desde el biorreactor, y ensayos similares a cabo en 2-D células se pueden aplicar a los agregados en 3-D con algunas consideraciones (Figura 1E-G). En este trabajo se describen los pasos detallados de cómo la cultura en 3-D agregados de células epiteliales en el sistema de biorreactor RWV y una variedad de ensayos y análisis posibles que se pueden ejecutar con los agregados de 3-D. Estos análisis incluyen, pero no se limitan a, estructural / manálisis de orphological (confocal, análisis y microscopía electrónica de transmisión), citocinas / quimiocinas y la secreción de señalización celular (matriz de citometría de cuentas y análisis de Western blot), análisis de expresión génica (PCR en tiempo real), análisis toxicológico / drogas y de las interacciones huésped-patógeno. La utilización de estos ensayos de sentar las bases para estudios más en profundidad y expansiva como la metabolómica, la transcriptómica, la proteómica y otras aplicaciones basadas en matrices. Nuestro objetivo es dar a conocer un medio no-convencionales de cultivo de células epiteliales humanas para producir organotípicos modelos 3-D que recapitula el ser humano en el tejido vivo, en un sistema fácil y robusto para ser utilizado por los investigadores con diversos intereses científicos.
Protocolo
Todos los pasos deben realizarse en condiciones BSL-2 en una campana de flujo laminar.
1. Preparación del biorreactor STLV
- Montar el biorreactor STLV según el protocolo del fabricante y realizar protocolo de desintoxicación para asegurar la esterilidad del biorreactor. Cubrir puertos abiertos con tapones luer y llenar el STLV con etanol al 95% durante 24 h.
- Eliminar el etanol y llenar el STLV con agua destilada esterilizada durante 24 h.
- Repita el paso 1.2 con agua destilada estéril solamente.
- Con la herramienta suministrada por el proveedor, afloje todos los tornillos, gorras y complementos del ce....
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Discusión
La utilización de la tecnología de biorreactores RWV que aquí se presenta puede proporcionar a los investigadores la capacidad para avanzar en su actual sistema de cultivo celular a un fisiológicamente más relevantes del modelo organotípico cultivo celular. El biorreactor RWV célula sistema de cultivo proporciona un microambiente bajo cizallamiento que permite a las células para formar agregados celulares en 3-D in vivo con características similares, incluyendo uniones estrechas, la producción de mucina, proces.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Brooke Hjelm por su experiencia técnica y Andrew Larsen por su análisis de proteínas. Este trabajo fue financiado en parte por la Fundación de Investigación de Alternativas para el Desarrollo (MMHK) y el NIH Grant NIAID Infecciones de Transmisión Sexual y microbicidas tópicos Centro de Investigación Cooperativa IU19 AI062150-01 (MMHK). Agradecemos Biología de la Reproducción para la reutilización de las cifras.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Se utiliza en la dilución 1:500 |
| FACSDiVa | BD | Citómetro de flujo | |
| β-tublin anticuerpos | Calbiochem | 654162 | Se utiliza en la dilución 1:5000 |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Biorreactor y componentes | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell colador | BD Falcon | 352340 | Tamaño de poro 40 micromolar |
| Tubo cónico (50 ml) | Corning | 5-538-60 | |
| Cubreobjetos | VWR | 48366067 | |
| Kits de citoquinas de la matriz de cuentas | BioRad | Kit humana personalizada | |
| Cytodex cuentas | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ácido etilendiaminotetraacético |
| Anticuerpos específicos epitelial (ESA) | Chemicon | CBL251 | Se utiliza en la dilución 1:50 |
| Suero fetal bovino (SFB) | Gibco | 10438 | Inactivado por calor |
| HARV (desechable) | Synthecon | D-405 | |
| Ácido clorhídrico | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrina anticuerpos | Sigma | I 9018 | |
| Portaobjetos | VWR | 16004-368 | |
| MTT reactivo | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 2.1) -2,5-difenil bromuro de tetrazolio |
| MUC1 anticuerpos (microscopía) | Santa Cruz | Sc-7313 | Se utiliza en la dilución 1:50 |
| MUC1 anticuerpos (citometría de flujo) | BD Pharmingen | 559774 | También se llama CD227, utilice 20ul por prueba |
| Paraformaldehído | Microscopía Electrónica de Ciencias | 15710 | Diluida al 4% en DPBS |
| Placa de Petri (pequeño) | BD Falcon | 353002 | |
| Poliestireno tubo con filtro | BD Falcon | 352235 | |
| Poliestireno tubo de flujo | BD Falcon | 352058 | |
| PR anticuerpos | Dako | M3569 | Se utiliza a la dilución 1:100 |
| Prolongar Oro | Invitrogen | P36931 | Medios de montaje con DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sulfato de sodio dodecil | Sigma | 71725 | |
| Esterilización bolsa | VWR | 11213-035 | |
| Llaves de paso (solo ida) | Medex | MX5061L | |
| Jeringa (10 ml) | BD | 309604 | Punta Luer-Lock |
| Jeringa (5 ml) | BD | 309603 | Punta Luer-Lock |
| Azul de tripano | Invitrogen | T10282 | |
| VP5 anticuerpos | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 de anticuerpos Clone 6F10, que se utiliza en la dilución 1:5000 |
Referencias
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M.
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Reimpresiones y permisos
