Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.
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Artículo de método
Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido
En este artículo
Resumen
Resumen
Nanopartículas biodegradables se han convertido en una plataforma versátil para el diseño e implementación de nuevas vacunas intranasales contra enfermedades infecciosas respiratorias. Específicamente, polianhídrido nanopartículas compuesto del ácido alifático sebácico (SA), la aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi) hexano (LPA), o la anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctano (CPTEG) muestran granel único y cinética de la superficie de erosión 1,2 y puede ser explotado para liberar lentamente biomoléculas funcionales (por ejemplo, antígenos proteicos, inmunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas tienen también actividad adyuvante intrínseca, por lo que una excelente elección para una plataforma de administración de la vacuna 6,7,8.
Con el fin de dilucidar los mecanismos que regulan la activación de la inmunidad innata la mucosa nasal después de la vacunación, se debe evaluar las respuestas moleculares y celulares del antígeno pcélulas resentidos (APC), responsables de iniciar la respuesta inmune. Las células dendríticas son las CPA principales que se encuentran en la realización de las vías respiratorias, mientras que los macrófagos alveolares (AMɸ) predominan en el parénquima pulmonar 9,10,11. AMɸ son altamente eficientes en la limpieza de los pulmones de los microbios patógenos y los residuos celulares 12,13. Además, este tipo de células juega un papel importante en el transporte de antígenos microbianos a los ganglios linfáticos de drenaje, que es un primer paso importante en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa 9. AMɸ también expresan niveles elevados de reconocimiento de patrones innatos y los receptores scavenger, los mediadores pro-inflamatorios secretan, y las células T vírgenes 12,14. Una población relativamente pura de AMɸ (por ejemplo, superior al 80%) se puede obtener fácilmente a través de lavado pulmonar para su estudio en el laboratorio. Residente AMɸ recogerá a partir de animales inmunes competentes faciliten un fenotipo representante de los macrófagos que encounter la vacuna basada en partículas in vivo. Aquí se describen los protocolos utilizados para la cosecha y la cultura AMɸ de ratones y examinar el fenotipo de la activación de los macrófagos después del tratamiento con nanopartículas polianhídrido in vitro.
Protocolo
1. La recolección macrófagos alveolares (AMɸ) del ratón usando lavado pulmonar
- Use equipos de protección personal (EPP), como una bata de laboratorio, guantes desechables y protección ocular adecuada.
- Preparar completa AMɸ (cAMɸ) medio antes del inicio de la cosecha. Añadir 2,5 ml de penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina) solución, 250 l de β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), y 25 ml de inactivado por calor suero fetal bovino (SFB) a 222,25 ml de medio modificado Dulbelcco de Eagle (DMEM). Filtro de esterilizar a medio cAMɸ con un 0,2 micras de tamaño de poro botella de filtro superior al vacío.
- La eutanasia de un ra....
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Discusión
Polianhidrido plataformas de la vacuna de nanopartículas han demostrado su eficacia cuando se administra por vía intranasal en los regímenes de dosis única 5. Medición de la activación de las poblaciones de células fagocíticas residentes en los pulmones inducidas por esta plataforma de administración de vacunas permite la evaluación de su capacidad potencial para promover en última instancia la respuesta inmune adaptativa.
En concreto, la cosecha macrófagos alveolares a partir del.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) para el apoyo financiero y el Dr. Shawn Rigby del Fondo Estatal de Iowa Citometría de flujo para la Universidad su experto en asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| AMPc medios de comunicación | |||
| DMEM | Cellgro | 15 a 013 CV | |
| 50 mM de 2-mercaptoetanol | Sigma | M3148-25ML | |
| La penicilina / estreptomicina 10.000 mg / ml de la Solución | Cellgro | 30 a 002-CI | |
| Suero Bovino Fetal | Atlanta Productos Biológicos | S11150 | |
| Tampón FACS | |||
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Fosfato sódico | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| El cloruro de potasio | Fisher Scientific | P217500 | |
| Fosfato de potasio | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (albúmina de suero bovino) | Sigma | A7888 | |
| Azida sódica | Sigma | S2002 | |
| Anticuerpos | |||
| IgG de rata | Sigma | I4341 | |
| Anti-Sra. CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Lucha contra el haplotipo MHC II Sra. IA / IE, el clon M5/114.15.2, conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) | EBIOSa ciencia | 11-5321 | |
| Anti-CD86 de ratón, clon GL-1, conjugado con aloficocianina (APC)-Cy7 | BioLegend | 105030 | |
| Anti-CD40 de ratón, clon 1C10, conjugado con APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-ratón, clon CD209 5H10, conjugado con biotina | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-ratón CD11b, el clon M1/70, conjugado con Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-ratón F4/80, clon BM8, conjugado con ficoeritrina (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-rojo de Texas conjugado estreptavidina | BD Biosciences | 551487 | |
| Otros suministros y reactivos | |||
| Etanol | Fisher Scientific | A405-20 | Se utiliza como 70% (v / v) |
| Comprimido de CO 2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 ml de jeringa | BD Biosciences | 309659 | |
| Soberano de 3 ½ "Padre Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Seguridad de la Biotecnología del Gabinete | Nuaire | Serie 22 | |
| Tijeras de disección | Pescador | 138082 | |
| Fórceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X sin calcio y magnesio | Cellgro | 21-040-CM | |
| Tubos de centrífuga de 15 ml con tapón de rosca | VWR International | 21008-216 | |
| Seis de cultivo de tejidos tratados placas | Costar | 3516 | |
| Bastidores de tubo de plástico | Nalgene | 5970 | |
| Rascador de células de 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 de poliestireno ml de fondo redondo del tubo | Halcón | 352008 | |
| Pipetear auxilios XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, y 2 mL Pipetas | Pescador | 13-675 | |
| 200 y 10 Micropipetas de l | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 y 10 puntas de pipeta l | Pescador | 02-707 | |
| La estabilización de BDFijador | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II diluyente | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II reactivo lítico | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter viales de poliestireno Contador | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Tubos de ensayo, | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipo | |||
| Centrífuga Refrigerada | Labnet | 50075040 | |
| Humidificado incubadora de CO 2 | Nuaire | Modelo Autoflow 8500 | |
| FACSCanto citómetro de flujo | BD Biosciences | 338960 | |
| Contador de partículas Coulter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Equipos de procesamiento de líquidos Sonicator con micropunta | Misonix | Modelo N º S-4000 |
Referencias
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. ....
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Reimpresiones y permisos
