El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Summary

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

Abstract

Sistemas de nanopartículas se han convertido en herramientas valiosas en la entrega de vacunas a través de su capacidad de entregar de manera eficiente la carga, incluyendo las proteínas, las células presentadoras de antígeno ^1-5. La internalización de las nanopartículas (NP) por las células presentadoras de antígenos es un paso crítico en la generación de una respuesta inmune efectiva contra el antígeno encapsulado. Para determinar cómo los cambios en la función del impacto de las nanopartículas formulación, hemos tratado de desarrollar un alto rendimiento, cuantitativa protocolo experimental que fuera compatible con la detección de nanopartículas internalizados, así como las bacterias. Hasta la fecha, dos técnicas independientes, microscopía y citometría de flujo, han sido los métodos utilizados para estudiar la fagocitosis de las nanopartículas. La naturaleza de alto rendimiento de la citometría de flujo genera datos estadísticos robustos. Sin embargo, debido a baja resolución, se produce un error de cuantificar con precisión internalizado versus celulares nanopartículas consolidados. Microscopía genera imágenes con alta resolución espacial, hin embargo, es mucho tiempo e involucra a pequeños tamaños de muestra ^6-8. Multi-espectral de la citometría de flujo de imágenes (MIFC) es una nueva tecnología que incorpora aspectos tanto de la microscopía y citometría de flujo que realiza multicolor de imágenes espectrales de fluorescencia de campo y brillante al mismo tiempo a través de un núcleo laminar. Esta capacidad proporciona un análisis preciso de la intensidad de la señal fluorescente y las relaciones espaciales entre las diferentes estructuras y funciones celulares a alta velocidad.

En este documento, se describe un método que utiliza MIFC para caracterizar las poblaciones celulares que han internalizado las nanopartículas polianhídrido o Salmonella enterica serovar Typhimurium. También describe la preparación de suspensiones de nanopartículas, el etiquetado de células, la adquisición de un sistema de IMAGESTREAM ^X y análisis de los datos mediante la aplicación de IDEAS. También demuestran la aplicación de una técnica que puede utilizarse para diferenciar la internalización pathways de las nanopartículas y las bacterias mediante el uso de citocalasina-D como un inhibidor de la fagocitosis mediada por actina.

Protocol

1. RAW 264.7 de Cultivos Celulares

1. Cosecha de células RAW 264.7 de sus frascos cuando llegan a la confluencia raspando suavemente con un raspador de células. Recuento y la placa de ellos en una placa celular de 24 pocillos de cultivo a una densidad de 5 x 10 ⁵ células / pocillo en 0,5 ml completa Medio de Dulbecco Modificado de Eagle (cDMEM; 10% inactivado por calor suero bovino fetal (FBS), 2 mM de Glutamax, y HEPES 10 mM) e incubar durante una noche a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora.

2. Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028 Transformación y Cultura

1. Introducir plásmido....

Discussion

Los estudios han demostrado que las nanopartículas biodegradables a base de poli (láctico-co-ácido glicólico (PLGA) o polianhídridos pueden ser utilizados para entregar antígenos encapsulados o fármacos a células diana. Captación de estas nanopartículas por las células fagocíticas es importante para su eficacia, haciendo así cuantitativo . análisis de la internalización crítico en el diseño de nuevos sistemas de entrega de nanopartículas Mediante este método, la absorción diferencial de nanopartículas de diversos tipos .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RAW 264.7 línea celular	American Type Culture Collection (ATCC)	TIB-71
Dulbecco Eagle modificado (DMEM)	Cellgro	10 a 013 CV
Suero bovino fetal	Atlanta Productos Biológicos	S 11150	Prima de Grado
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
24-pocillos	TPP	92024
Frascos de cultivo celular	TPP	90151
Rascador de la célula	TPP	99002	24 cm
Salmonella enterica serovar Typhimurium	ATCC	14028
BTX ECM630 Manipulador célula electroquímica	BTX Harvard Apparatus
MOPS	Fisher Scientific	BP308
Tampón fosfato salino (PBS)	Cellgro	21 a 040 CV
Procesador de líquidos por ultrasonidos	Misonix	S-4000
Citocalasina-D	Sigma-Aldrich,	C8273
Formaldehído	Polysciences	04018
El tampón de lavado	2% de FBS inactivado por calor, 0,1% de azida sódica en PBS.
Perm / tampón de lavado	BD Biosciences	554714
Clear-ver microtubos Cap Snap	Sigma	T4816
Alexa Fluor 660 phalloidin	Invitrogen	A22285
IMAGESTREAM X	Amnis Corporación	100200	Opciones: 658nm láser, inyector automático
Azida de sodio	Fisher Scientific	S 227i-500