Summary
Sexuelle Kreuze und Isolierung von rekombinanten Nachkommen sind wichtige Werkzeuge für die Forschung Fadenpilz,
Abstract
Fusarium graminearum hat sich zu einem Modellsystem für Studien in der Entwicklung und Pathogenität der Fadenpilze. F. graminearum am leichtesten produziert Fruchtkörper, genannt Perithezien, auf Karotten-Agar. Perithecien enthalten zahlreiche Gewebearten, in bestimmten Phasen der Entwicklung Perithecium produziert. Dazu gehören (in der Reihenfolge ihres Auftretens) Bildung der Perithecium Initialen (was Anlass zu der ascogenen Hyphen), die Außenwand, Paraphysen (sterile Myzelien, die das Zentrum des Perithecium besetzen, bis die Asci entwickeln), die Asci, und die Ascosporen innerhalb der Asci 14. Die Entwicklung jedes dieser Gewebe wird von ungefähr 24 Stunden getrennt und war die Grundlage der Transkriptom-Studien während der sexuellen Entwicklung 12,8. Siehe Hallen et al. (2007) für eine ausführliche Beschreibung der Entwicklung, darunter Aufnahmen von jeder Etappe. Hier präsentieren wir die Methoden zur Erzeugung und Ernte von synchronenly Entwicklung von Rasenflächen Perithezien für zeitliche Untersuchungen der Genregulation, Entwicklung und physiologischen Prozessen. Obwohl diese Methoden sind speziell auf die mit F. verwendet werden geschrieben graminearum, können die Techniken für eine Vielzahl von anderen Pilzen verwendet werden, vorausgesetzt, dass Fruchtkörper in Kultur induziert werden und es gibt synchron zur Entwicklung. Vor kurzem haben wir dieses Protokoll angepasst, um die sexuelle Entwicklung von F. untersuchen verticillioides. Obwohl einzelne Perithecien müssen Hand in dieser Art aufgenommen werden, weil ein Rasen entwickeln Perithezien nicht induziert werden konnte, arbeitete das Verfahren auch zur Untersuchung von Entwicklung (Sikhakolli und Trail, unveröffentlicht).
Die wichtigste Funktion von Pilzfruchtkörper ist die Verbreitung der Sporen. In vielen der Arten der Ascomycota (Ascus Herstellung Pilze), werden die Sporen aus dem Ascus gedreht, aufgrund der Erzeugung der Turgordruck im Ascus, Antreiben Ausstoßen von Sporen (und epiplasmic Fluid) durch diePore in der Spitze 2,7 Ascus. Unsere Untersuchungen der gewaltsamen Sporenemission haben in der Entwicklung eines "Sporenausstoß Assay", die wir verwenden, um auf Mutationen in den Prozess Bildschirm führte. Hier präsentieren wir Ihnen die Details dieses Tests.
F. graminearum ist homothallischen, und somit kann Fruchtkörper in der Abwesenheit eines kompatiblen Partner bilden. Der Vorteil ist, dass homothallism Kreuzung ist nicht notwendig, Nachkommen homozygot für ein bestimmtes Merkmal, eine Facette, die die Untersuchung der sexuellen Entwicklung ermöglicht hat bei dieser Art 14,7 erzeugen. Allerdings haben heterothallisch Stämme wurden generiert, die für das Überschreiten der 5,9 verwendet werden. Es ist auch möglich, homothallischen Stämme kreuzen, um Mutanten für mehrere Gene in einem Stamm 1 zu erhalten. Dies wird durch coinoculating einer Petrischale mit 2 Stämmen durchgeführt. Entlang der Treffpunkt, wird die Mehrheit der Perithezien rekombinant sein (vorausgesetzt, die eine Mutation in einem der Elternstämme nicht hemmtAuskreuzung). Als Perithecien Alter, verströmen sie Ascosporen en masse statt gewaltsam entladen sie. Die resultierenden Sporen Exsudat (eine so genannte Cirrus) liegt an der Spitze des Peritheciums und kann leicht für die Rückgewinnung von einzelnen Sporen entfernt werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Identifizierung von rekombinantem Perithecien und die Gewinnung von rekombinanten Nachkommen zu erleichtern.
Protocol
1. Producing Perithecien
- Zentrale inokulieren Karotten-Agar 10 in einer 6,0 cm Durchmesser Petrischale mit einer fruchtbaren Stamm von F. graminearum (PH empfehlen-1).
- Ort beimpften Schalen unter hellen Leuchtstoffröhren bei Raumtemperatur (18-24 ° C) und erlauben zu wachsen, bis Myzel den äußeren Rand der Petrischale (3-5 Tage) erreicht hat. Kommerzielle Haushalt Leuchtstoffröhren arbeiten für die Stimulierung Fruchtkörper Bildung und Entladung in Ordnung.
- Entfernen Sie vorsichtig die Luftmycelien mit einem sterilen Zahnstocher.
- Verteilen 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq an der Oberfläche mit einem sterilen Glas Hockeystick oder abgerundeten Ende einer sterilen Glasstab.
- Zurück Platten ans Licht. Fügen Sie nicht zu Parafilm Platten.
- Nach 24 Stunden sollte die Oberfläche der Platten haben ein glänzendes Aussehen. Wenn Myzelien erscheint wieder, kratzen Oberfläche und erneut bewerben Tween-60-Lösung.
- Beobachten Sie die Entwicklung der Perithecien in der nächsten Woche. Die intermediären Stufen derPerithecium Entwicklung kann durch sanftes Abkratzen der Oberfläche des Agar und Flash zur RNA-Extraktion (1) gefroren geerntet werden.
- Reifen Sporen werden auf dem Deckel der Platte bis zum Tag 7 ansammeln. Zunächst werden diese nur sichtbar, unter einem Binokular, sondern von Tag 9, sie werden um eine ausreichende Dichte angesammelt haben, so dass sie mit bloßem Auge.
2. Ascosporenausschleuderung Assay
- Am Tag 6 nach der Anwendung von Tween-Lösung, schneiden Sie ein 1 cm Durchmesser Kreise aus dem Agar mit einem Holz-Bohrer. Alternativ kann ein Skalpell verwendet, um eine ähnlich große Segment entfernt werden. Der Kreis kann in zwei Hälften geschnitten und jede Hälfte platziert auf einem Objektträger.
- Orient die Stücke so dass die Oberfläche mit den Fruchtkörper senkrecht zu der Oberfläche der Folie, und die Sporen sind über die gesamte Länge des Schiebers gebrannt.
- Legen Sie den Objektträger in einer feuchten Kammer über Nacht unter Beleuchtung. Die Sporen werden auf akkumulierender Schieber und sichtbar für das bloße Auge am nächsten Morgen (Abbildung 2).
- Kumulierte Sporen können aus der Folie mit Wasser gewaschen und quantifiziert werden, falls gewünscht.
- Mögliche Sporenemission Inhibitoren können, indem sie in der Rückseite des Agarblock bei der Montage des Assays getestet werden. Einige Ionenkanal-Inhibitoren, die Entladung zu verringern wurden bereits mit dieser Technik 15 getestet.
3. Erzeugung von rekombinanten Nachkommen
- Initiieren Sie durch Impfen Karotten-Agar mit zwei Stämme von F. überqueren graminearum (ein Nit + und ein nit-), indem die Impfung Punkte auf gegenüberliegenden Seiten der Petrischale.
- Sobald Hyphen haben die Oberfläche gefüllt, abkratzen Antenne Teil und gelten Tween-60-Lösung wie oben beschrieben. Verwenden Sie einen Marker, um auf der Seite der Petrischale, wo die Hyphen erfüllen beachten.
- Zurück Kulturen zu Licht und inkubieren bis Perithecien entwickelt haben, und cirrhi haben seinPistole aus der Perithecien entlang der Schnittlinie zwischen den beiden Kulturen zu bilden.
- Unter dem Binokular, bringen in den Blick der Perithezien entlang der Schnittlinie der beiden Kulturen. Mit Hilfe eines Insekts Pin, sterilisiert und in sterilem Wasser getaucht, berühren Sie eine Cirrus entlang dieser Grenze leicht mit der Spitze des Stifts. Die Feuchtigkeit auf den Stift sollte es den Cirrus, um den Stift zu halten.
- Spülen Sie die Spitze des Stifts mit der Cirrus darauf in 200 ul sterilem Wasser in ein Eppendorf-Röhrchen, um die Sporen abwaschen.
- Flamme der Stift, befeuchten Sie es erneut und wählen Sie ein anderes Cirrus. Haupt 10-15 cirrhi, und jeden in einem separaten Röhrchen Wasser.
- Vortexen Röhrchen mit cirrhi suspendiert.
- Entfernen 60 ul der Sporensuspension mit einer Pipette und auf MMTS Medium 1 in einer 9 cm-Petrischale. Verbreiten Sie mit einer sterilen Hockeyschläger. Der verbleibende Sporensuspension kann bei 4 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden und bei Bedarf erneut ausplattiert.
- Incubate bei Raumtemperatur (Licht nicht notwendig) für 3-5 Tage, bis sehr kleine Kolonien erscheinen (Abbildung 3). Es werden zwei Arten von Phänotypen zu den Kolonien. Die NIT-Kolonien haben spärlicher als die Hyphen Nit +-Kolonien. Cirrhi von rekombinantem Perithecien zeigen beide Phänotypen Kolonie in etwa gleichen Anteil. Entsorgen Sie die Platten mit Kolonien von nur einem einzigen Phänotyp auf sie. Beachten Sie, dass manchmal mehr als zwei Phänotypen durch Segregation von anderen Faktoren zur Folge haben.
- Bewegen Sie Kolonien auf V8-oder Karotten-Agar für die Lagerung. Test-Kolonien auf Czapek Dox-Agar 's (die nit-Stämme nicht auf Czapek Dox die wachsen) und auf PDA mit Chlorat (0,5 M Kaliumchlorat; die Nit +-Stämme nicht auf PDA mit Chlorat wachsen), um die richtige Phänotyp zu bestätigen. Untersuchen Sie diese Kolonien für die gewünschten Qualitäten.
4. Repräsentative Ergebnisse
Producing Perithezien
Das Ziel ist, einen Rasen habenPerithezien ohne Myzelien oder Sporen sichtbar. Die Oberfläche der Kultur erscheint wie in schwarzem Samt (Abbildung 1). Nach 24 Stunden nach der Anwendung der Tween die Oberfläche des Agar sollte eine leichte Glanz. Wenn Myzelien wieder auftauchen, dann kann die Platte nicht gekratzt haben genug zu Perithecium Entwicklung zu induzieren.
Ascosporenausschleuderung
Immer in Ihrer Assay mehrere Blöcke von Agar bieten von der Wildtyp-Stamm. Wenn diejenigen, die nicht tun, Feuer, dann ist entweder Ihre Perithezien sind zu jung oder zu alt. Wenn sie zu alt sind, können zur Hyphen wird über die Oberfläche der Kultur gibt es eine weißliche Farbe angezeigt. Ist dies nicht der Fall, können sie zu jung sein, und der Test sollte in 24 Stunden erneut versucht werden. Gelegentlich haben Kulturen nicht gut zu entladen, und das Experiment muss wiederholt werden. Achten Sie darauf, Sie führen den Test unter den richtigen Lichtverhältnissen.
Rekombinante Nachkommen
Abbildung 1. Stadien der Entwicklung Perithecium auf Karotten-Agar. Linke, 72 h nach der Anwendung von Tween. Beachten Sie, rotes Pigment und sehr junge Perithecien sichtbar als schwarze Körner auf der Oberfläche. Richtig, bei 144 h, haben reifen Perithecien gebildet. Beachten Sie nahezu vollständigen Fehlen von oberflächlichen Myzelien in beiden Kulturen.
Abbildung 2. Discharge-Test. Die orangefarbene Karotte Agarpfropfen ist so ausgerichtet, that Sporen zwangsweise aus dem reifen Perithecien auf seiner Oberfläche entladen kann auf der Oberfläche des Objektträgers zu akkumulieren. 15 Stunden Akkumulations-Zeit.
Abbildung 3. Unterschiede im Wachstum zwischen Nit + und Nit-Kolonien auf selektiven MMTS Medium. Die NIT-Kolonien (Pfeilspitzen) sind kleiner. Die Nit +-Kolonien (Pfeile) zeigen ein robustes Wachstum. Foto nach 7 Tagen genommen.
Discussion
F. graminearum ist besonders gut auf das Studium der Fruchtkörper Entwicklung aufgrund der Verfügbarkeit eines gut kommentierten Genoms (angepasst mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / , 4), und die Verfügbarkeit eines Affymetrix- Basis Microarray-6. Dies hat die Fähigkeit, Gene, die für Sporenemission 7,11,3 identifizieren erleichtert. Die hier vorgestellten Methoden wird es der Forscherin, auf einer bestimmten Reihe von Entwicklungsstadien und Funktionen für die genetische Analyse der Fruchtkörper von F. konzentrieren graminearum. Die Verfahren sind ebenfalls leicht an erhältlichen Pilze, die Früchte in Kultur induziert werden kann, und kann als Standard für die Entwicklung in einer Vielzahl anderer Pilz Fruchtkörper Typen verwendet werden.
Die Fähigkeit, eine Spore Brennen Phänotyp beurteilen kann bei Arten, wo Sporen sind klein und schwer zu sehen, wie subtil
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (MCB-0923794 bis FT) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek’s Dox Agar | Difco Laboratories | 233810 | |
| Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |
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