Summary
Сексуальные кресты и изоляции рекомбинантного потомства являются важным инструментом исследования для нитчатых грибов,
Protocol
1. Производство Перитеции
- Центр прививки морковь агар 10 в 6,0 см диаметр чашки Петри с плодородной штамма F. graminearum (рекомендуется PH-1).
- Место привиты блюда под яркой лампы дневного света при комнатной температуре (18-24 ° С) и позволяют расти, пока мицелий достигает внешнего края чашки Петри (3-5 дней). Коммерческая бытовых люминесцентных ламп прекрасно работать для стимулирования плодоношения формирования тела и разряда.
- Аккуратно снимите воздушный мицелий стерильным зубочисткой.
- Распространение 1,0 мл 2,5% Tween 60 AQ на поверхность стерильным hockeystick стекла или закругленный конец стерильной стеклянной палочкой.
- Вернуться пластин на свет. Не добавляйте к парафильмом пластин.
- После 24 часов, на поверхности пластин должна иметь блестящий внешний вид. Если мицелий появляется, поверхностные царапины и повторно применить твин-60 решение.
- Соблюдайте развития перитеции в течение следующей недели. Промежуточных стадияхperithecium развития могут быть собраны, мягко очищая поверхность агара и флэш заморожены для выделения РНК (рис. 1).
- Зрелые споры будут накапливаться на крышке пластинки в день 7. Первоначально это будут видны только под микроскопом рассечения, но 9-й день, они накопили достаточной плотности, чтобы быть видимыми невооруженным глазом.
2. Аскоспор разряда Пробирной
- На 6-й день после нанесения раствора Tween, нарезать 1 см диаметр круга из агара с дерева сверло. Кроме того, скальпель может быть использован для удаления такого же размера сегмента. Круг может быть нарезанный пополам и каждую половину помещают на предметное стекло микроскопа стекло.
- Восток куски так, поверхность, содержащую плодовые тела перпендикулярно к поверхности слайда, а также споры уволен по всей длине затвора.
- Поместите слайд в камере влажности в течение ночи в свет. Споры будут накапливаться наскольжения и быть видимыми невооруженным глазом на следующее утро (рис. 2).
- Накопленный споры могут быть смыты водой слайдов и количественно, если это необходимо.
- Потенциальные аскоспор ингибиторов разряда могут быть проанализированы, добавив их в обратную сторону агара при сборке блока анализа. Некоторые ингибиторы ионных каналов, которые снижают разряд ранее анализировали с помощью этой техники 15.
3. Генерация рекомбинантного потомства
- Начать пересекать путем посева моркови агар с двумя штаммами F. graminearum (один Nit + и один-нит), поставив прививку точек на противоположных сторонах чашки Петри.
- После гифы заполнили поверхность, соскрести воздушной части и применить твин-60 решение, как описано выше. Используйте маркер, чтобы отметить на стороне чашки Петри, где гифы с концами.
- Вернуться культуры к свету и инкубировать до перитеции разработали и cirrhi были бытьпистолет для формирования из перитеции по линии пересечения двух культур.
- При вскрытии микроскоп, привести в просмотр перитеции по линии пересечения двух культур. Использование насекомых контактный, стерилизуют и опускают в стерильную воду, трогать cirrhus вдоль этой границы легко кончиком пальца. Влажность на выводе должно позволить cirrhus придерживаться выводов.
- Промойте кончик штифта с cirrhus на нем в 200 мкл стерильной воды в пробирку Эппендорфа мыть спор с.
- Пламя вывод, смочите его снова и выбрать другой cirrhus. Выберите от 10 до 15 cirrhi, и поместить каждый в отдельную пробирку с водой.
- Кратко вихревых труб, содержащих взвешенные cirrhi.
- Удалить 60 мкл суспензии спор с помощью пипетки и место на ММТС среды 1 в 9 см блюдо Петри. Распространение стерильным хоккейной клюшкой. Остальные подвески спор может храниться при температуре 4 ° С до недели и replated если это необходимо.
- Инкубациите при комнатной температуре (свет не обязательно) в течение 3-5 дней, пока очень небольшие колонии (Рисунок 3). Там будет два вида фенотипов среди колоний. Нит-колоний будет редким, чем гиф колоний Nit +. Cirrhi из рекомбинантных перитеции покажет как колония фенотипов примерно в равных пропорциях. Откажитесь от пластин с колониями только одного фенотипа на них. Обратите внимание, что иногда более чем в два фенотипа привести в связи с разделение других факторов.
- Перемещение колонии V8 или морковный агар для хранения. Испытание колонии на Dox агар Чапека (нит-штаммы не будут расти на Dox Чапека) и на КПК с хлорат (0,5 М хлорат калия, Nit штаммов + не будет расти на КПК с хлорат), чтобы подтвердить правильность фенотипа. Изучите эти колонии для желаемого качества.
4. Представитель Результаты
Производство перитеции
Цель состоит в том, чтобы газонперитеции без мицелия или спор очевидной. Поверхность культуры будет похож на черный бархат (рис. 1). В 24 часов после применения Tween поверхности агара должны быть легким блеском. Если мицелии появляются, то плита не может быть Царапины достаточно, чтобы вызвать perithecium развития.
Аскоспор разряда
Всегда предоставлять в анализе нескольких блоков агар от штамма дикого типа. Если те, не срабатывают, то либо ваш перитеции слишком молод или слишком стар. Если они слишком старые, то многочисленные гифы появится на поверхности культуры придав ему беловатый оттенок. Если это не так, они могут быть слишком молоды, и анализа должны быть вновь в 24 час. Иногда, культуры не выполнять хорошо, и эксперимент придется повторить. Убедитесь, что вы выполните тест при определенных условиях освещения.
Рекомбинантный потомство
Рисунок 1. Этапы развития perithecium на морковь агара. Левые, 72 ч после применения Tween. Обратите внимание, красный пигмент, и очень молодые перитеции видны как черные зерна на поверхности. Да, на 144 ч, зрелые перитеции сформировались. Обратите внимание, почти полное отсутствие поверхностного мицелия в обеих культурах.
Рисунок 2. Разряда анализа. Оранжевый разъем агар морковь ориентирован так, тхат спор принудительно выписали из зрелых перитеции на ее поверхности может накапливаться на поверхности стекло. 15 часов времени накопления.
Рисунок 3. Различия в росте между Nit + и нит-колоний на селективной среде ММЦ. Нит-колоний (наконечники стрел) меньше. Нить + колоний (стрелки) показывает устойчивый рост. Фотография сделана через 7 дней.
Discussion
Ф. graminearum особенно хорошо приспособлены к изучению плодоношения развитие тела в связи с наличием хорошо аннотированного генома ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / 4), а также наличие Affymetrix- основанный микрочипов 6. Это способствовало возможность идентифицировать гены, важные для аскоспор разряда 7,11,3. Методы, представленные здесь, позволяют исследователю сосредоточиться на дискретный набор этапов развития и функций для генетического анализа плодовых тел F. graminearum. Эти методы также легко адаптируется к связанным грибов, которые могут быть вызваны на фрукты в культуре, и может быть использован в качестве стандарта для развития целого ряда других грибковых типов тела плодоношения.
Способность оценивать фенотип стрельбы спор может быть тонким в вид, где споры малого и трудно понять, например,
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом от Национального научного фонда (MCB-0923794 для FT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek’s Dox Agar | Difco Laboratories | 233810 | |
| Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |
References
- Bowden, R. L., Leslie, J. F.
- Buller, A. H. R. Researches on Fungi. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
- Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
- Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
- Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
- Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
- Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
- Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
- Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
- Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
- Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).
- Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
- Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
- Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).
