Caracterización de los mecanismos moleculares de la<em&gt; En vivo</em&gt; Catarata inducida por RUV

Konstantin Galichanin; Nooshin Talebizadeh; Per Söderberg

doi:10.3791/4016

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Caracterización de los mecanismos moleculares de la

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DOI:

10.3791/4016

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28 de noviembre de 2012

Konstantin Galichanin¹^,² , Nooshin Talebizadeh² , Per Söderberg²

¹St. Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, ²Gullstrand lab, Section for Ophthalmology, Department of Neuroscience, Uppsala University

En este artículo

Resumen

La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo. Radiación solar ultravioleta (UVR) es el principal factor de riesgo para el desarrollo de cataratas. Un modelo animal de lejos catarata inducida por UVR-B fue desarrollado. En este artículo se describen los métodos para la investigación de la formación de cataratas: La exposición a los rayos UV, cuantitativos RT-PCR e inmunohistoquímica.

Resumen

La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo ^1. La Organización Mundial de la Salud define catarata como una opacidad del cristalino del ojo que impide la transmisión de la luz. La catarata es una enfermedad multifactorial asociada con la diabetes, el tabaquismo, la radiación ultravioleta (UVR), alcohol, radiación ionizante, los esteroides y la hipertensión. Hay una fuerte evidencia experimental ^2-4 y epidemiológica ^5,6 UVR que provoca catarata. Hemos desarrollado un modelo animal para UVR B catarata inducida en ambos anestesiados ⁷ y los animales no anestesiados ^8.

La única cura para las cataratas es la cirugía, pero este tratamiento no es accesible a todos. Se ha estimado que un retraso de la aparición de cataratas durante 10 años podría reducir la necesidad de cirugía de cataratas en un 50% ^9. Para retrasar la incidencia de cataratas, que es necesario para comprender los mecanismos de la formación de cataratas y encontrar estrategia eficaz de prevencióngias. Entre los mecanismos para el desarrollo de cataratas, la apoptosis desempeña un papel crucial en la iniciación de cataratas en los seres humanos y los animales ^10. Nuestro enfoque ha sido recientemente apoptosis en la lente como el mecanismo para el desarrollo de cataratas ^8,11,12. Se prevé que una mejor comprensión del efecto de la radiación UV en la vía de la apoptosis se proporcionan posibilidades para el descubrimiento de nuevos productos farmacéuticos para prevenir cataratas.

En este artículo se describe cómo catarata puede ser inducida experimentalmente por la exposición en vivo a los rayos UV-B. Además RT-PCR e inmunohistoquímica se presentan como herramientas para estudiar los mecanismos moleculares de la RUV-B inducida por la catarata.

Protocolo

1. La exposición a la radiación ultravioleta

15 min antes de la exposición, anestesiar una hembra Sprague-Dawley con una mezcla de 90 mg / kg Ketalar (ketamina) y 10 mg / kg Rompun (xilazina) por inyección intraperitoneal.
Colocar el animal en un limitador de rata y apretar las correas hasta la inmovilización de la rata sin causar una compresión de tronco ^13.
Infundir Mydriacyl (tropicamida), 10 mg / ml, en ambos ojos de la rata para inducir midriasis.
Colocar el animal de modo que un ojo se coloca contra un haz estrecho de radiación UV a 300 nm con un ancho de ¹⁴ nm 10 a media altura y proteger el ojo contralateral con cinta de color negro.
Exponer la rata unilateralmente por debajo del umbral de dosis 1 kJ / m ² RUV-B a 300 nm durante 15 minutos ^15.

2. Disección

Después de la pre-determinado intervalo de post-exposición (1, 5, 24 y HR 120), sacrificar la rata de seis semanas de edad (peso <200 g) por carbon asfixia dióxido de carbono y la dislocación de las vértebras cervicales.
Ojos enucleación. A continuación, coloque la córnea del ojo hacia abajo, lado posterior hacia arriba. Entonces, perfore un agujero mínimo mediante la aplicación de una cánula de calibre 27 y empuje tangencial a la esclerótica para evitar dañar la lente que está muy cerca de la esclerótica. A continuación, utilice un par de tijeras de cirugía oftálmica para cortar circunferencialmente justo detrás del limbo hasta que la parte posterior de la esclerótica se puede quitar. A continuación, levante la lente con unas pinzas curvas romas.
Eliminar los restos del cuerpo ciliar desde el ecuador del cristalino bajo un microscopio, manteniendo la lente en solución salina equilibrada de no más de 5-10 min.

3. RT-PCR cuantitativa

Colocar una lente en una mezcla de 350 l tampón de lisis RA1 (NucleoSpin RNA II Kit de aislamiento de ARN total) y 3,5 l β-mercaptoetanol en un tubo Eppendorf de 2 ml.
Mantener la lente en esta mezcla durante 30 min a temperatura ambiente.
Homogeneizar la lente conuna aguja hasta sólo núcleo duro del cristalino que queda de la lente (la corteza y la cápsula de la lente se lisaron en tampón de lisis). Retire el núcleo de la mezcla.
Almacenar las muestras inmediatamente a -70 ° C.
Descongele las muestras y seguir el protocolo "Total purificación de ARN a partir de células cultivadas y tejidos" (NucleoSpin RNA II Kit de aislamiento de ARN total).
Tienda de muestras de ARN a -70 ° C.
Para verificar la eliminación suficiente de ADN de cada muestra, ejecutar una PCR en las condiciones siguientes (paso 1: 95 º C durante 2 min; paso 2 durante 40 ciclos: 95 ° C durante 20 s, 55 ° C durante 20 s, 72 ° C durante 20 seg; paso 3: 72 º C durante 7 min) con cebadores específicos de ADN de p53, adelante 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'y revertir 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' y Taq ADN polimerasa (dNTPack), de acuerdo con la fabricación protocolo. El producto de PCR esperada es 243 pares de bases.
Ejecutar un 1,5% electroforesis en gel de agarosa para detectar el producto de PCR específico de ADN de 243 pares de bases. Para preparar1,5% de gel de agarosa en tampón TBE tomar 3,75 g de agarosa y resolverlo en 250 ml de tampón TBE. Añadir bromuro de etidio (0,5 mg / ml) 500 l en 500 ml de solución de gel de agarosa al 1,5%. Calentar la mezcla en un horno de microondas y se agita para resolver la agarosa.

Ninguna de las muestras tiene que revelar cualquier producto de PCR específicas de ADN en electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.

Medir la concentración de las muestras de ARN (1 l) y la relación de absorbancia de la muestra a 260 nm (RNA) y 280 nm (proteína) en un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro. Si el ARN a la proteína de la relación de absorbancia de la muestra de ARN es 2,0 o más, entonces la muestra de ARN es puro. Si la relación de absorbancia de la muestra de ARN es menor que 2,0, rehacer etapa de purificación de ARN 3,5.
Tomar un volumen de muestra de RNA correspondiente a 1 mg y sintetizar cDNA siguiendo el protocolo 1 Kit ^st Strand cDNA de síntesis (1 kit ^st Strand cDNA de síntesis para la RT-PCR).
Almacenar las muestras de ADNc a -20 º C(Por un período de 1 y más años, almacenan a -70 ° C).
Ejecutar cuantitativa en tiempo real PCR en iCycler MyiQ único sistema de detección de color real PCR en tiempo. Carga triplicados en placas de 96 pocillos con 1 l de muestra cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, ensayo TaqMan Gene Expression para la caspasa 3, de acuerdo con las instrucciones de fabricación. Carga triplica en otra placa de 96 pocillos con 1 l de muestra cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, ensayo TaqMan Gene Expression para mayores de 18, de acuerdo con las instrucciones de fabricación (TaqMan Gene Expression Protocolo de ensayo). Diluir en serie una fracción de cDNA a partir de tres elegidas al azar y no expuestas lentes. Ejecutar diluciones en serie junto con el ADNc de las muestras en una placa de 96 pocillos.
Usar el método de la curva estándar para la cuantificación de los resultados. El número de ciclos en la fluorescencia umbral se utiliza como la medida en software MyiQ. Una curva estándar que expresa el número de ciclos en el umbral como función de la concentración relativa de calibrador es consultadatablished para las diluciones en serie en cada placa. ADNc a partir de tres muestras no tratadas de lentes se utiliza para la calibración. Relacionar el número de ciclos de umbral para cada muestra a la curva estándar para obtener la concentración relativa de la muestra de ADNc medido. Finalmente, obtener el nivel de expresión de los genes diana mediante la relación de la concentración relativa de ADNc diana a los 18 años de control de cDNA internos.

4. La tinción inmunohistoquímica

Fijación
1. Diseccionar el ojo en PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7,4).
2. Poner el ojo en un tubo lleno con 4% de paraformaldehído (PFA) en frío de hielo durante 20 min. Preparar PFA 4% el día antes. Almacenar a 4 ° C hasta su uso. PFA es fresco durante aproximadamente una semana.
3. Eliminar PFA con una micropipeta. A continuación, lavar con PBS enfriado en hielo durante 20 min.
4. Poner el ojo en sacarosa 30% a +4 º C durante la noche.
5. Poner el ojo en una copa llena con la temperatura óptima de corte (OCT)-medio (Tissue-Tek). Poner el ojo en una posición adecuada para el corte.
6. Congelar en octubre mediano con hielo seco.
7. Almacenar a -70 ° C hasta su uso.
Seccionamiento
1. Coloque el ojo para la crio-corte en un plano adecuado.
2. Cortar tres 5 m de espesor medio sagital secciones desde una parte central de cada lente. Descartar al menos 6 secciones entre las secciones secuenciales para evitar manchar los mismos núcleos en diferentes secciones.
3. Una vez que una sección ha sido cortada, coloque suavemente una diapositiva en la parte superior de la misma. La sección a continuación, debe apegarse a la diapositiva.
4. Agregar los portaobjetos se seque al aire antes de su uso. Diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C hasta su utilización.
Fluorescencia inmunohistoquímica
1. Deje que las muestras de alcanzar la temperatura ambiente (5-10 min).
2. Dibujar bordes alrededor de las muestras con un PAP-pen (Invitrogen).
3. Deje que la frontera seca durante un tiempo (10 min).
4. Etiquetar los portaobjetos de microscopio.
5. Rehidratar en 1 × PBS durante 15 min.
6. Permeabilizar en solución estándar de bloque durante 30 min.
7. Añadir anticuerpo primario (policlonal de conejo caspasa-3, troceados anticuerpo Asp175 9661; Tecnología de Señalización Celular, Inc), diluido 1:3000 en solución de bloqueo estándar.
8. Almacenar en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche.
9. Lavar en PBS por pipeteado (3 x 5 min) o por inmersión en un baño de gran tamaño (> 15 min, 1-2 cambios).
10. Añadir anticuerpo secundario (anticuerpo de conejo anti secundaria con una específica de absorción / emisión del espectro) diluido 1:300 en la solución estándar de bloque.
11. Lavar en PBS por pipeteado (3 x 5 min) o por inmersión en un baño de gran tamaño (> 15 min, 1-2 cambios).
12. Limpie el pen-PAP frotis.
13. Almacenar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 h. Evite la exposición a la luz.
14. Añadir una gota de Vectashield y colocar un cubreobjetos sobre el portaobjetos. Evite hacer burbujas.
15. Dejar cuajar Vectashield (~ 20 min).
16. Mantenga apartados in la oscuridad hasta su análisis.
17. Todas las secciones de control se procesan en ausencia de anticuerpo primario.
18. Busque los resultados dentro de unas pocas horas bajo un microscopio de fluorescencia.
19. Contar núcleos de células epiteliales desde un lado del arco nuclear a proa del otro lado nuclear de cada lente. Aplicar el filtro azul estándar para ver todos los núcleos epiteliales de la lente en azul y un filtro estándar que se ajuste a la emisión del anticuerpo secundario para ver los núcleos positivos caspasa-3 en verde.
20. Registrar el número de todos los núcleos epiteliales de la lente y el número de núcleos positivos. Contar las células tres veces para cada sección.