Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Resumen

Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.

Resumen

Dentro del intestino residen poblaciones únicas de las células inmunitarias innatas y adaptativas que están involucrados en la promoción de la tolerancia hacia la flora comensal y antígenos alimentarios, mientras que concomitantemente a punto restante para montar las respuestas inflamatorias hacia el ^1,2 patógenos invasores. Células presentadoras de antígeno, en particular los PED y los macrófagos, juegan un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis inmune intestinal a través de su capacidad de detectar y responder apropiadamente a la microbiota ^3-14. El aislamiento eficiente de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales es un paso fundamental en la caracterización del fenotipo y la función de estas células. Mientras que muchos métodos eficaces de aislar intestinales células inmunes, incluyendo los DC y macrófagos, han sido descritos ^6,10,15-24, muchas veces se basan en digestiones largas que pueden influir negativamente superficie celular expresión del antígeno, la viabilidad celular, y / o el rendimiento de la célula. Aquí, detalles de una metodología para el aislamiento rápido de un gran número de viable, los países en desarrollo y los macrófagos intestinales. Caracterización fenotípica de los DC intestinales y macrófagos se lleva a cabo por tinción aislados directamente con las células intestinales específicas fluorescencia-etiquetados anticuerpos monoclonales para el análisis de flujo de múltiples colores citometría. Por otra parte, CC de alta pureza y de las poblaciones de macrófagos están aislados de los estudios funcionales utilizando CD11c y CD11b magnética activadas por cuentas de células de clasificación seguido por la selección de células.

Protocolo

1. La disección y la disociación de las células intestinales

Preparación de los reactivos y equipos:

• Cálido Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} libre de PBS (CMF PBS) a temperatura ambiente.
• Caliente Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-libres} HBSS con FBS al 5% (HBSS CMF / FBS) y 2 mM EDTA a temperatura ambiente.
• Cálido agitador orbital a 37 º C.

Nota: Los pasos de 1,1 a 1,7 debe realizarse lo más rápidamente posible para minimizar el grado de muerte celular y para lograr el máximo rendimiento celular.

1. La eutanasia de los ratones en una cám....

Discusión

Figura 3. Factores importantes para la optimización del rendimiento de la célula y la expresión del antígeno de superficie. Rendimiento de la célula y la expresión del antígeno de superficie son afectados directamente por la duración de la digestión del tejido, las características específicas de la colagenasa, el grado de tejido picado, y la presencia o ausencia de inflamación, que puede afectar a la integridad del tejido y celularidad. D.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PBS 1X, Ca 2 + - y Mg 2 + libre
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con rojo fenol	Fisher Scientific	SH3001603
De bicarbonato de sodio	Sigma	S6014
HEPES 1M en NaCl al 0,85%	Lonza	17-737E
Suero fetal bovino (SFB)	Atlanta biológicos	S11150H	Inactivado por calor
EDTA 0,5 M (pH 8,0)	Cellgro	46 a 034-CI
Collagenase tipo VIII	Sigma	C2139
DNasa I	Roche	14785000	Una solución de archivo: 100mg/ml
LIVE / DEAD Se fija de Aqua kit de Dead Cell Mancha para la excitación de 405 nm	Invitrogen	L34957	Utilice a 1:1000
CD45-PerCP MAB (30F11)	BD	557235	Utilice a 1:100
CD103-PE MAB (M290)	BD	557495	Utilice a 1:100
FcγRIII / II MAB (2.4G2)	BD	553141	El uso de 1:200
CD11c-APC MAB (N418)	eBioscience	17-0114-82	Utilice a 1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 MAB	eBioscience	56-5321-82	Utilice a 1:100
CD11b-450 eFluorMAB (M1/70)	eBioscience	48-0112-82	El uso de 1:200
F4/80-PE-Cy7 MAB (BM8)	eBioscience	25-4801-82
CD11b microperlas	Miltenyi Biotec	130-049-601
CD11c microperlas	Miltenyi Biotec	130-052-001
50 ml tubos cónicos	BD Falcon	352098
Sola malla colador de alambre	Chefmate
Pequeño barco de peso	Fisher Scientific	08-732-116
100 micras filtro de células	BD Falcon	352360
40 micras filtro de células	BD Falcon	352340
5 mL de poliestireno de fondo redondo tubos	BD Falcon	352235	Utilice a 1:100
MaxQ 4450 de sobremesa agitador orbital	Thermo Scientific
LS MACS columna	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSR II	BD
FACSAria II	BD