Guiada por tomografía computarizada dominio del tiempo de fluorescencia difusa tomografía en pequeños animales para la localización de biomarcadores de cáncer

Summary

La tomografía de fluorescencia difusa ofrece un enfoque relativamente de bajo costo y alto potencial de toda la preclínica En vivo Tumor de imágenes. La metodología de recopilación de datos óptica, calibración y reconstrucción de la imagen se presenta para una guiada por tomografía computarizada sin contacto el dominio del tiempo del sistema usando fluorescentes la orientación de los biomarcadores del tumor epidérmico receptor del factor de crecimiento en un modelo de glioma de ratón.

Abstract

Pequeños animales de fluorescencia molecular de imágenes (FMI) puede ser una poderosa herramienta para el descubrimiento de medicamentos preclínicos y estudios de desarrollo ^1. Sin embargo, la absorción de luz por los cromóforos del tejido (por ejemplo, la hemoglobina, el agua, los lípidos, la melanina) suele limitar la propagación de la señal óptica a través de espesores mayores que unos pocos milímetros ^2. En comparación con otras longitudes de onda visibles, la absorción del tejido para el rojo e infrarrojo cercano (IR cercano) absorción de la luz disminuye drásticamente y no la dispersión elástica de la luz se convierte en el dominante del tejido mecanismo de interacción. El desarrollo relativamente reciente de los agentes fluorescentes que absorben y emiten luz en el rango infrarrojo cercano (600-1000 nm), ha impulsado el desarrollo de sistemas de imágenes y modelos de propagación de luz que puede alcanzar todo el cuerpo en tres dimensiones de imagen en pequeños animales ^3.

A pesar de grandes avances en este campo, la naturaleza mal planteado de la tomografía por fluorescencia difusa sigue siendo un importanteproblema para la estabilidad, la recuperación de contraste y resolución espacial de las técnicas de reconstrucción de imagen y el enfoque óptimo a FMI en pequeños animales todavía no se ha acordado. La mayoría de los grupos de investigación han invertido en el dispositivo de carga acoplada (CCD), los sistemas basados ​​en la sensibilidad que proporcionan abundante tejido de muestreo, pero subóptima ^4-9, mientras que nuestro grupo y algunos otros ^10-13 han seguido los sistemas basados ​​en detectores de alta sensibilidad , que en este momento permitir el muestreo tejido denso que se logra sólo a costa de rendimiento de imagen bajo. Aquí se demuestra la metodología para la aplicación de un solo fotón tecnología de detección en un sistema de tomografía de fluorescencia para localizar una lesión cerebral canceroso en un modelo murino.

La fluorescencia de positrones (FT), sistema empleado solo fotón contando con tubos fotomultiplicadores (PMT) y rica en información de dominio de tiempo de detección de la luz en una conformación sin contacto ^11. Esto proporciona una col simultánealección de la excitación de transmisión y emisión de luz, e incluye control automático de la exposición de fluorescencia de excitación ^14, referencia láser, y co-registro con un pequeño animal de tomografía computarizada (microCT) del sistema ^15. Un modelo de ratón desnudo se utiliza para la formación de imágenes. El animal fue inoculado orthotopically con una línea celular humana glioma (U251) en el hemisferio cerebral izquierdo y la imagen después de 2 semanas. El tumor se hizo una fluorescencia mediante la inyección de un trazador fluorescente, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico, una proteína de membrana de la célula sabe que se sobreexpresa en la línea de tumor U251 y muchos otros tipos de cáncer ^18. Un segundo, no directo fluorescentes del marcador, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) se inyectó también para dar cuenta de los efectos mediados por los receptores no en la captación de los marcadores dirigidos a proporcionar un medio de cuantificar la unión del marcador y del receptor de la disponibilidad / densidad ^27. Guiada por tomografía computarizada, time-dominio algoritmo se utilizó para reconstruir la ubicación de ambos marcadores fluorescentes (es decir, la localización del tumor) en el cerebro del ratón y su capacidad para localizar el tumor fue verificada por contraste mejorado de resonancia magnética.

Aunque demostrado para imágenes de fluorescencia en un modelo de ratón glioma, la metodología presentada en este vídeo se puede extender a diferentes modelos de tumores en diversos modelos animales pequeños potencialmente hasta el tamaño de una rata ^17.

Protocol

1. Preparación de Animales

1. Anestesie ratón desnudo (Charles River, Wilmington, MA) con inyección intraperitoneal de ketamina-xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg ip).
2. Coloque el ratón en el marco estereotáctico, hacer una incisión en el cuero cabelludo en la parte izquierda del cráneo y usando una aguja de calibre 18, crear una de 1 mm de diámetro del agujero en el cráneo de 2 mm de la línea central y 2 mm detrás de la bregma.
3. Inyectar ⁵ × 10 5 células de glioblastoma humano U251 neuronales (amablemente proporcionados por el Dr. Mark Israel, en el Dartmouth College, Hanover, NH) en 5 l de solución amortiguadora de fosfato en el hemisferio cerebral izquierdo, a una profundidad de aproximadamente 2 mm por debajo de la superficie de la cerebro. Utilizar una micro-jeringa Hamilton ¹⁸ y romo una terminó 27-aguja de calibre para la implantación de células e insertar la punta de la aguja 3 mm de la superficie externa del cráneo y luego retirar 1 mm para crear un bolsillo para las células.
4. Sutura sitio de la incisión y permiten redescubrimiento de la cirugía.
5. Espere ~ 14 días para permitir el crecimiento del tumor antes de la exploración.

2. Fluorescencia Tomografía Calibración del sistema

1. En el día de la imagen del ratón, iniciar el sistema y permitir que los láseres y detectores de luz para calentar durante aproximadamente 20 minutos para evitar derivas en la sensibilidad del sistema.
2. Coloque un 100 º por 4 º de ingeniería línea de difusor (Thorlabs, Newton, Nueva Jersey) en el centro directo del pórtico de imagen, normal a la del láser de excitación: un picosegundo de pulso de 80 MHz multimodo de diodo láser de 635 nm (PicoQuant Fotónica del Norte America Inc., Westfield, MA). Ajustar el ángulo del difusor para maximizar la cantidad de la señal detectada por los cinco canales de recogida de luz. Una descripción completa de la geometría de la imagen se proporciona en ^11,14,15.
3. Coloque OD 2 filtros de densidad neutra (Thorlabs, Newton, Nueva Jersey) en frente de todos los tubos fotomultiplicadores de detección de fluorescencia (PMT) y OD 1 filtros de densidad neutra (Thorlabs, Newton, Nueva Jersey) en frente de todos los PMT de transmitancia de detección. Recoge 100 perfiles temporales propagación de pulsos (TPSF) del láser, cada uno con un tiempo de integración de 1 s.
4. Normalizar cada TPSF por la referencia láser, corregir la deriva temporal en la referencia de láser, y promedio de todas las iteraciones de cada detector. Estos TPSFs promedio son las funciones específicas del instrumento detector de respuesta (IRF) que se utilizan en la reconstrucción de la imagen óptica.

3. Imagen Protocolo

1. Anestesie el ratón con 2% de isoflurano en oxígeno (1 l / min).
2. Inyectar 1 nanomol de IRDye 800CW-EGF y 1 nanomol de Alexa Fluor 647 en 100 ml de solución amortiguadora de fosfato, por vía intraperitoneal, 12 horas antes de la imagen para apuntar factor de crecimiento epidérmico receptor de la sobreexpresión en el tumor.
3. Coloca el ratón sobre la fibra de vidrio compatible con la imagen de la cama, arreglar el ratón de manera que su nariz se mantiene en un cono de la entrega de la anestesia con isoflurano.
4. Enasegurarse de que el ratón se coloca apropiadamente en la cama: es decir, que cuando la cama está asegurado en el sistema de tomografía de fluorescencia el ratón está en el centro aproximado de la imagen de pórtico. Este posicionamiento puede ser guiado por girar el láser de excitación 180 ° alrededor del ratón, asegurando que el punto focal del láser ilumina un punto aproximadamente en el centro del ratón desde la perspectiva del láser en todos los ángulos.
5. Una vez colocado, transferir cuidadosamente la cama de imágenes y el ratón a la microCT (explorar Locus, GE Healthcare, London, ON) del escáner y obtener información anatómica con una resolución de 93-m isotrópica para toda la cabeza del ratón.
6. Visualice la pila de la imagen CT y elegir el segmento (s) para obtener imágenes con el sistema de tomografía por fluorescencia.
7. Transferir cuidadosamente la cama de imagen y ratón de vuelta al sistema de tomografía de fluorescencia. Elija el número de posiciones de la fuente para recoger datos sobre el ratón por cada imagen SLICe (32), el tiempo de integración para cada medición TPSF (1 s), el número de iteraciones para cada posición de la fuente (10), y la posición y el número de rebanadas de imagen deseados desde la pila de imágenes CT de la Etapa 3,6. Los números entre paréntesis son valores típicos para cada parámetro de la imagen produciendo ~ 5 minutos de la adquisición de datos de imágenes por rebanada.
8. Coloque los filtros de triple ranura (Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT), frente a los PMT de detección de fluorescencia, para restringir cualquier luz láser de alcanzar los detectores de fluorescencia, y DO 2 filtros de densidad neutra frente a los PMT de transmitancia de detección para evitar la saturación de dichos detectores.
9. Ejecutar el software de adquisición de datos, la recogida de fluorescencia y TPSFs transmitancia en cada posición de la fuente detector definido y para cada longitud de onda de excitación (635 nm y 755 nm para excitar el Alexa Fluor 647 y IRDye trazadores 800CW-EGF, respectivamente). Para cada conjunto de TPSFs conseguidas, controlar y registrar la intensidad del lásercon un canal de PMT de referencia.

4. Imagen de Reconstrucción

1. Determinar la superficie exterior del ratón y la ubicación de las varillas de soporte de imagen de cama de las imágenes CT y crear máscaras que cubren los confines del ratón y las barras de formación de imágenes por separado.
2. Utilice la máscara de ratón para producir una malla de elementos finitos del animal utilizando el software NIRFAST ^19.
3. Localizar las posiciones fuente y el detector de fluorescencia del sistema de tomografía en la superficie de la malla sobre la base de microCT y registro de fluorescencia espacial coordenadas ^20.
4. Quitar puntos de datos ópticos asociados con las posiciones de origen o detector que interactúan con la ubicación de las varillas de soporte de imagen de cama.
5. Normalizar los datos recogidos en cada posición de detector de la fuente de la referencia del láser, la corrección de la deriva de la referencia temporal en el láser, y corregir la sensibilidad del filtro, que se determinaron mediante análisis experimentales en el momento de la compra ^15.
6. Tomar la Proporción Nacido de los datos (fluorescencia dividido por transmitancia) para cada posición de la fuente-detector y se multiplican con un modelo de simulación por delante de la transmitancia sobre la base de la malla animales de elementos finitos para uniformes propiedades ópticas. Esto se hace para mitigar los errores asociados con acoplamiento fuente-o detector de ^tejido-21, para calibrar los datos para el modelo ^22, y para ajustar los datos para otros aspectos de desajuste modelo de datos ^23,24.
7. Construir un vector de datos compuesta por la diferencia en escala de los datos de proporción nacidos recogidos en ambas longitudes de onda. El factor de escala se elige para maximizar el contraste EGFR unión. Realizar el dominio del tiempo reconstrucción de la imagen con los datos de diferencia calibrados utilizando el TPSF para cada canal de detección como una entrada, y crear mapas de fluorescencia de la trazador de contraste mejorado dirigidos ^15.

5. Los resultados representativos

"> Un ejemplo de una reconstrucción de fluorescencia superpuesta con una imagen anatómica co-registrada TC de la cabeza de un ratón con un tumor U251 glioma ortotópico se presenta en la Figura 1b. El centro de masa del glioma determinada por la reconstrucción fluorescente (Figura 1b ) fue menos de 1 mm del centro de tumores de la masa determinada por el contrario, mejorar la imagen de resonancia magnética (Figura 1a). Las imágenes de la TC y la RM fueron co-registradas sobre la base de una transformación mutua de la información.

Figura 1. Realzada con contraste (gadolinio) de la imagen por resonancia magnética de la cabeza del ratón (a). El ratón fue inoculado orthotopically con una línea celular humana U251 glioma. La localización del tumor, que absorbe más agente de contraste que el cerebro normal, se puede ver en el hemisferio cerebral izquierdo (a la derecha en la imagen) y se indica por la flecha blanca. El corresponding computarizada tomografía imagen (de la misma ubicación en la cabeza del ratón) se representa en (b) con el factor de crecimiento epidérmico dirigido fluorescencia menos el superpuesto no directo reconstrucción de fluorescencia. Las unidades de fluorescencia están en mm inversa y se relacionan con el coeficiente de absorción de la fluorescencia enlazado específico multiplicado por su eficiencia cuántica y por su concentración.

Discussion

Fluorescencia de positrones (FT) es un tema delicado, las radiaciones ionizantes sin técnica de imagen molecular basada en el transporte de luz visible y del infrarrojo cercano a través del tejido biológico. La mayor parte del interés en el FT se ha centrado en su potencial para acelerar el descubrimiento de fármacos y el desarrollo en animales pequeños modelos experimentales ¹ y un área clave de investigación ha sido el estudio de la expresión de biomarcadores de cáncer y la respuesta a las terapias moleculares ^26. En la actualidad, hay dos enfoques que compiten en el diseño del sistema FT. El diseño más común se basa en la refrigeración del dispositivo de carga acoplada (CCD), cámaras para detección de fluorescencia ^4-9. Este diseño proporciona una alta densidad de mediciones, maximizando muestreo de tejido, ya que cada píxel de la cámara CCD puede detectar la luz que ha viajado un camino único a través del tejido. Sin embargo, las cámaras CCD tienen un rango dinámico limitado y el ruido de lectura limita su mayor sensibilidad. El segundo diseño evita el potencial limitación ciones de detección cámara CCD mediante el empleo de alta sensibilidad de un solo fotón tecnología recuento basado en el uso de detectores tales como tubos fotomultiplicadores o fotodiodos de avalancha ^10-13. El inconveniente de estos métodos de detección más sensible es que cada detector sólo puede recoger la luz en un solo punto, por lo tanto, para lograr muestras de tejido denso, ya sea muchos detectores tienen que ser utilizados (que es muy caro), o muchas proyecciones tienen que ser fotografiada con el mismo detector (que puede llevar mucho tiempo). Mientras que el nivel óptimo de muestras de tejido para el FT pequeño animal no ha sido acordado, y puede variar en una base de caso por caso, se ha acordado que la instrumentación de fotón único conteo es más adecuado para explorar los límites de sensibilidad de FT en términos de su capacidad para detectar bajas concentraciones de los marcadores moleculares. En este estudio, se propone una metodología para llevar a cabo FT utilizando un solo fotón de instrumentación de detección de cómputo para localizar tumores en ratones.

ent "> Hay cuatro pasos críticos implicados para producir conjuntos de datos robustas con el tiempo-correlacionada fotón único FT recuento. La primera es la aplicación de un procedimiento de calibración adecuado y directo. En la metodología presentada, las sensibilidades respectivas de cada canal de detección se tienen en cuenta por recoger una medición de base de luz de excitación transmitida a través de una línea-difusor diseñado para dirigir fracciones iguales de luz a cada detector ^15. Además, la luz detectada durante un experimento es continuamente calibrado a la referencia de láser, tanto en términos de intensidad y la media . tiempo, lo que podría fluctuar con el tiempo, por el funcionamiento de un canal de láser de referencia ^11,15 El segundo paso crítico es la colección precisa y co-registro de imágenes anatómicas para guiadas reconstrucciones fluorescencia Los datos FT solo no ofrece ninguna información anatómica.; por lo tanto, con el fin de crear un modelo de transporte de la luz que se puede utilizar para reconstruir la LOcatión de fuentes fluorescentes dentro de un espécimen de la fluorescencia detectada en la superficie de la muestra, la anatomía de la muestra en relación con el sistema FT debe ser exactamente conocida. En nuestro sistema, la información anatómica es adquirido por un sistema de tomografía computarizada micro con coordenadas espaciales que han sido registrados espacialmente con las del sistema de FT ^15,20. El paso crítico tercera consiste en garantizar que una exposición óptima (es decir, el tiempo total de detección de fotones por cada proyección de láser) se emplea en cada posición de la fuente-detector. Esto es importante por dos razones: primero, para asegurar que no es adecuada relación señal-ruido en cada posición de detección y segundo para evitar la saturación del detector, que podría dañar las unidades de detección. Con el fin de conseguir una exposición óptima en cada posición del detector, un control automático de exposición se emplea, que esencialmente triangula la exposición óptima de dos, de baja señal exposiciones ^14. El cuarto críticopaso de la metodología se hace referencia a los datos recogidos de fluorescencia a la cantidad de luz de excitación transmitida. Esta referencia se llama a menudo la relación del Born, y proporciona muchos beneficios para los pies, con la principal es la mitigación de errores de incompatibilidad de datos en modelos ^23,24. El sistema presentado fue diseñado para detectar la luz de excitación tanto de fluorescencia y transmitida simultáneamente por la canalización de la luz en cada canal de detección en 2 tubos fotomultiplicadores separadas. Al hacer esto, evitar cualquier efecto de movimiento sobre la exactitud de la relación de Born.

Con un conjunto de datos robusta que la mano, la reconstrucción de la imagen de los datos de dominio de tiempo consiste en resolver el problema inverso de la malla de elementos finitos que tiene la expresión:

d = Jx

donde d es un vector con n x m elementos de n detector de fuente de las proyecciones y el tiempo m TPSF puertas; J es un n x m-por-l sensibilidad matriz (o Jacobiana), para los nodos l en la malla, y x es el vector de las propiedades ópticas de fluorescencia en cada nodo, teniendo l tamaño d es los datos calibrados recogidos durante el experimento y J es simulado usando la solución de elementos finitos. a la aproximación del tiempo de difusión dominio de transporte de fluorescencia ^25. La dimensión temporal de J está también convolucionada con los detectores específicos funciones del instrumento de respuesta. X es una representación del mapa de fluorescencia de interés y se resuelve para el uso de un Levenberg-Marqardt no negativo enfoque de mínimos cuadrados con Tikhonov regularización ^15.

La metodología presentada aquí, que describe un procedimiento capaz de localizar tumores marcadas fluorescentemente en ratones utilizando altamente sensibles conteo de fotones detección por fluorescencia, tiene el potencial para empujar los límites de FT. En un estudio anterior, el potencial de emplear esteenfoque en las grandes-que-ratones modelos animales, como ratas, así como una mejor sensibilidad en el diseño de sistemas existentes en el tamaño del ratón-las muestras, se ha demostrado ^17. La aplicación inmediata de este enfoque sería que el control de la expresión de biomarcadores en vivo en pequeños modelos animales de tumores para evaluar la eficacia del fármaco en un medio de alto rendimiento. La capacidad del sistema para excitar y detectar la fluorescencia a longitudes de onda múltiples permite la detección simultánea de múltiples marcadores fluorescentes. Otros marcadores fluorescentes proporcionan un medio para interrogar a los múltiples aspectos de una patología, al mismo tiempo, o podrían ser utilizados, como en este estudio, a emplear métodos de imagen más cuantitativos, tales como los métodos de doble reportero de la medición en el potencial de unión in vivo, un marcador de densidad de los receptores ^26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidil éster	Tecnologías de la Vida	A20106	Reaccionar con agua para minimizar no específicos de unión