La liofilización es a menudo una manera fácil y conveniente de obtener productos secos de células bacterianas viables. Un problema del proceso es la supervivencia celular. Nos detalle aquí un procedimiento para investigar cómo la supervivencia celular durante la liofilización está influenciada por las propiedades de la formulación utilizada.
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Artículo de método
Las formulaciones para la liofilización de las bacterias y su influencia en la supervivencia celular
En este artículo
Resumen
Resumen
Agua celular se puede quitar para inactivar microorganismos reversible para facilitar el almacenamiento. Uno de tales métodos de eliminación es la liofilización, que se considera un método de deshidratación suave. Para facilitar la supervivencia celular durante el secado, las células se formulan a menudo de antemano. La formulación forma una matriz que incorpora las células y los protege de diversas tensiones perjudiciales impuestas a las células durante la congelación y el secado. Se presenta aquí un método general para evaluar la tasa de supervivencia de las células después de la liofilización y que se ilustra mediante la comparación de los resultados obtenidos con cuatro formulaciones diferentes: la sacarosa, el disacárido sacarosa polímero derivado de Ficoll PM400, y los respectivos polisacáridos hidroxietil celulosa (HEC ) e hidroxipropil metil celulosa (HPMC), en dos cepas de bacterias, P. putida KT2440 y A. A6 chlorophenolicus. En este trabajo se ilustra cómo preparar formulaciones para la liofilización y cómo investigar la mecánicaismos de la supervivencia celular después de la rehidratación mediante la caracterización de la formulación utilizando de calorimetría diferencial de barrido (DSC), mediciones de tensión superficial, análisis de rayos X, y la microscopía electrónica y en relación a los datos de las tasas de supervivencia. Los polímeros se eligen para obtener una estructura monomérica del respectivo polisacárido sacarosa se asemeja a un mayor o menor grado. El uso de este método de instalación que mostramos que los polímeros pueden apoyar la supervivencia de las células tan eficazmente como disacáridos si ciertas propiedades físicas de la formulación son controlados 1.
Protocolo
1. El cultivo y la cosecha de P. putida
- Preparar un cultivo iniciador de Pseudomonas putida mediante la inoculación de 100 ml de caldo de soja tríptico (TSB) con una colonia de P. células putida cultivadas en agar suplementado con caldo de soja tríptico (TSA). Mantener el cultivo a 30 ° C en un tablero de agitación fijado en 130 rpm.
- Después de 7 h transferir una alícuota del cultivo iniciador equivalente a 1/10 del volumen final del cultivo principal a la TSB-medio fresco. Mantener las células a 30 ° C en un tablero de agitación a 130 rpm durante 16 horas.
- Después de 16 h de crecimiento de las célula....
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Resultados
La Tabla 1 muestra los datos sobre la composición de la formulación, eventos térmicos registrados por DSC durante el calentamiento de las formulaciones congeladas, la estructura de las muestras secas y la tensión superficial de las soluciones de formulación. La Tg 'de sacarosa se ha determinado a -40 ° C 2, 3 y puede ser difícil de detectar para concentraciones de sacarosa inferior al 20% w / w. El evento térmico a -35 ° C está probablemente relacionado con la aparic.......
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Discusión
El motivo de este estudio fue investigar algunas propiedades de formulación que puedan ser de importancia para la supervivencia celular durante la liofilización. Aunque la tolerancia intrínseca secado varía entre las diferentes especies, como se ilustra en la Figura 1A, la tendencia de qué tan bien la diferente supervivencia de las células de soporte formulaciones es similar. Es informativo para comenzar con una comparación de la sacarosa y Ficoll. Se cree que un factor clave para una formulación para a.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica Ambiental (MISTRA) a través del programa de DOM y Grant 211684 (BACSIN) del Programa Marco de la Unión Europea Comunidad 7PM. Damos las gracias a J. Engstrand de asistencia en la filmación del análisis de rayos X y L. Tang por su ayuda en la narrativa conceptual.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Donación de Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Donación del Departamento de Farmacia, Universidad de Uppsala | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Caldo de soja tripticasa | Merck | 105459 | |
| Agar de soja tripticasa | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Difractómetro Bruker AXS SMART CCD 1k | Bruker | N.A | |
| FIB/SEM de haz dual FEI Strata DB235 | FEI | N.A | |
| Tensiómetro educativo Krüss | Krüss | N.A. |
Referencias
- Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
- Ablett, S., Izzard, M. J., et al. Differential Scanning....
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Reimpresiones y permisos
