Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los macrófagos En vivo, Que derivan de los macrófagos polarizados aspirados de médula ósea, y la transferencia adoptiva macrófagos en ratones. Estas técnicas permiten determinar el papel que los macrófagos polarizados desempeñan en la salud y la enfermedad.
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Artículo de método
El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos son participantes cruciales en la respuesta inmune innata a cualquier reto infeccioso o lesión, iniciando la respuesta inmune innata y la dirección de la respuesta inmune adquirida. La disfunción de macrófagos puede conducir a la incapacidad de montar una respuesta inmune adecuada y, como tal, ha sido implicado en muchos procesos patológicos, incluyendo las enfermedades inflamatorias del intestino. Los macrófagos muestran fenotipos polarizadas que se dividen en dos categorías. Macrófagos activados Clásicamente, activada por la estimulación con LPS o IFN, desempeñan un papel esencial en la respuesta a la exposición a las bacterias, mientras que los macrófagos activados alternativamente, activada por IL-4 o IL-13, participar en los residuos de barrido y la remodelación tisular y han sido implicados en la resolución fase de la inflamación. Durante una respuesta inflamatoria in vivo, los macrófagos se encuentran en medio de una mezcla compleja de la infiltración de células inmunes y puede participar por exacerbar o resolvinag inflamación. Para definir la función de los macrófagos in situ en un modelo animal completo, es necesario examinar el efecto de agotamiento de los macrófagos del entorno complejo. Para hacer preguntas sobre el papel de fenotipo de macrófagos in situ, fenotípicamente definidos los macrófagos polarizados se pueden derivar ex vivo, a partir de aspirados de médula ósea y se añade de nuevo a los ratones, con o sin el agotamiento previo de los macrófagos. En el protocolo presentado aquí clodronato liposomas que contienen, en comparación con los controles de PBS inyectados, se utilizaron para agotar los macrófagos colon durante dextrano sulfato de sodio (DSS)-colitis inducida en ratones. Además, los macrófagos polarizados se obtuvieron ex vivo y se transfiere a los ratones por inyección intravenosa. Una advertencia de este enfoque es que los liposomas que contienen clodronato agotan todos los fagocitos profesionales, incluyendo tanto las células dendríticas y los macrófagos para asegurar el efecto observado por el agotamiento de los macrófagos es específica, la reconstitución ofenotipo f por transferencia adoptiva de los macrófagos es necesario. Agotamiento macrófagos sistémica en ratones también se puede lograr por retrocruzamiento ratones sobre un fondo CD11b-DTR, que es un enfoque complementario excelente. La ventaja de clodronato contiene mediada por liposomas agotamiento es que no requiere el tiempo y los gastos implicados en ratones retrocruzamiento y que puede ser utilizado en ratones con independencia del fondo de los ratones (C57BL / 6, BALB / c, o fondo mixto ).
Protocolo
1. Los macrófagos que agotan la Utilización de liposomas que contienen clodronato
- Los liposomas se almacenan a 4 ° C. Dos horas antes de la inyección, retire clodronato que contienen liposomas, los liposomas que contienen PBS o PBS estéril (inyección de control) del refrigerador para permitir que se adapte a la temperatura ambiente (18 ° C).
- Invertir los tubos que contienen liposomas 8-10 veces para asegurar una distribución uniforme antes de cargar 200 l en una jeringa de 1 ml. Colocar una aguja de calibre 26 a la parte superior de la jeringa.
- Con la mano izquierda pescuezo, el ratón debajo de las orejas que sostienen la piel lo sufici....
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Discusión
Los macrófagos son células fagocíticas que juegan un papel importante en el sistema inmunológico. Ellos son los responsables de iniciar la respuesta inmune innata y la dirección de la respuesta inmune adquirida. Típicamente, los macrófagos activados clásicamente son activados por IFN o LPS y son responsables de la eliminación de patógenos y montaje de una respuesta inflamatoria 1. A la inversa, los macrófagos activados alternativamente se activan por la IL-4 o IL-13 y jugar un papel en los desechos de barrido.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una "subvención al Servicio de la Investigación" de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of Canada al LMS, que se apoya en una Asociación Canadiense de Gastroenterología / Asociación Canadiense de Investigación en Salud / enfermedad de Crohn 's and Colitis Foundation Premio de Canadá, New Investigator.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Que contienen clodronato-liposomas | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS que contienen liposomas | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS estéril pH 7,4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Suero fetal bovino (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| ácido acético | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monotioglicerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| RECOMBnante murino MCSF | StemCell Tecnologías | 02951 | |
| Recombinante GM-CSF murino | StemCell Tecnologías | 02935 | |
| Recombinante IL-3 murina | StemCell Tecnologías | 02903 | |
| Recombinante murino IFN | StemCell Tecnologías | 02746 | |
| Recombinante de IL-4 murino | StemCell Tecnologías | 02714 | |
| Disociación celular buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rata anti-F4/80 anticuerpos | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-anticuerpos Argi | BD Transduction Laboratories | 610708 |
Tabla 1. Reactivos específicos utilizados en este protocolo.
Referencias
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. <....
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Reimpresiones y permisos
