Se describe el método para producir prototípico cubreobjetos de microscopio recubiertos de gelatina fluorescente para visualizar invadopodios mediada por la degradación de la matriz. Técnicas computacionales utilizando software disponible se presentan para la cuantificación de los niveles resultantes de la proteólisis matriz por las células individuales dentro de una población mixta y para los grupos multicelulares que abarcan todo campos microscópicos.
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Artículo de método
La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares
En este artículo
Resumen
Resumen
La invasión celular del tejido local es un proceso importante en el desarrollo y la homeostasis. Malregulated invasión y el movimiento celular subsiguiente es característica de varios procesos patológicos, incluyendo la inflamación, la enfermedad cardiovascular y la metástasis de células tumorales 1. La degradación proteolítica focalizada de la matriz extracelular (ECM) componentes de la membrana basal epitelial o endotelial es un paso crítico en la iniciación de la invasión celular. En las células tumorales, extensa en análisis in vitro ha determinado que la degradación de ECM se logra ventrales estructuras de membrana ricas en actina-protrusivos denominados invadopodios 2,3. Invadopodios forma en estrecha aposición a la ECM, donde moderada desglose ECM a través de la acción de las metaloproteinasas de matriz (MMP). La capacidad de las células tumorales para formar invadopodios se correlaciona directamente con la capacidad de invadir el estroma local y en los componentes vasculares asociadas 3. _content "> Visualización de invadopodios mediada por la degradación de ECM de las células por microscopía de fluorescencia utilizando marcada con colorante de proteínas de la matriz recubiertos sobre cubreobjetos de vidrio se ha convertido en la técnica más frecuente para evaluar el grado de proteólisis de la matriz y potencial invasivo celular 4,5. Aquí se describe una versión del método estándar para generar fluorescente marcada con cubreobjetos de vidrio utilizando un comercialmente disponibles Oregon Green-488 conjugado de gelatina. Este método se puede ampliar fácilmente para producir rápidamente grandes cantidades de cubreobjetos recubiertos. Nos muestran algunos de los artefactos comunes microscópicas que se encuentran a menudo durante este procedimiento y cómo estos pueden ser evitados. Finalmente, se describen métodos normalizados utilizando el software de ordenador fácilmente disponibles para permitir la cuantificación de la degradación de la etiqueta matriz de gelatina mediada por células individuales y por completo poblaciones celulares. Los procedimientos descritos proporcionan la capacidad para controlar con precisión y de forma reproducible invadopodiosactividad, y también puede servir como una plataforma para la evaluación de la eficacia de la modulación de la expresión de proteínas o el ensayo de anti-invasivos compuestos sobre la degradación de la matriz extracelular en los ajustes individuales y multicelulares.
Protocolo
1. Producción de Oregon Green 488-cubreobjetos recubiertos de gelatina
- Preparar una etiqueta 5% (w / w) stock de gelatina / solución de sacarosa mediante la adición de 1,25 g de gelatina y 1,25 g de sacarosa en PBS hasta un volumen final de 50 ml. Se calienta la solución madre de gelatina a 37 ° C y asegurarse de que está totalmente derretido antes de su uso. La tienda de la mezcla final a 4 º C.
- Limpiar 13 mm de diámetro # 1 cubreobjetos de vidrio, colocando un cubreobjetos individuales en cada pocillo de una placa de 24 pocillos de plástico de cultivo de tejidos. Añadir 500 l de 20% de ácido nítrico a cada pocillo e incubar durante 30 min. Aspi....
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Discusión
La capacidad de visualizar las células que degradan la matriz extracelular ha ayudado en el descubrimiento de los mecanismos moleculares empleados en los pasos tempranos de la invasión celular. Por primera vez por Wen-Tien Chen en el 1980 principios de 4,14,15, revestimiento de la etiqueta fluorescente proteínas extracelulares en cubreobjetos de vidrio para análisis microscópico posterior se ha convertido en la principal técnica para evaluar la función invadopodios a través de una amplia gama de tipos de célu.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos de dotación de la Universidad de West Virginia María Babb Randolph Cancer Center. Damos las gracias a Susette Mueller (Georgetown University) y Laura Kelley para asesoramiento y una asistencia. La utilización del Fondo para la Universidad de West Virginia imágenes Microscopía (apoyado por el Mary Babb Randolph Cancer Center y subvenciones NIH P20 RR16440, RR032138 P30 y P30 GM103488) Se agradece.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / instrumento | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| gelatina | Sigma | G1890 | Porcino piel |
| sacarosa | Pescador | BP220 | |
| 12 mm cubreobjetos | Pescador | 50-121-5159 | |
| Placas de 24 pocillos | Pescador | 08-772-1 | BD Falcon |
| ácido nítrico | Ricca | R5326000 | 20% de solución |
| poli-L-lisina | Microscopía Electrónica de Ciencias | 19320-B | 0,1% de solución |
| glutaraldehído | Sigma | G7526 | 8% de solución |
| Oregon Green 488-conjugado de gelatina | Invitrogen | G-13186 | |
| borohidruro de sodio | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Pescador | BP151 | |
| rodamina-faloidina | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clon 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anticuerpo anti-FLAG | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 cabra anti-IgG de ratón | Invitrogen | A21235 | |
| Prolongar Antifade Oro | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 microscopio confocal | Zeiss | ||
| ImageJ software | Dominio público | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements | Nikon |
Referencias
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder,....
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Reimpresiones y permisos
