ADN vectorial basado en el ARN de interferencia para estudiar la función génica en el cáncer

Resumen

ARN de interferencia (RNAi) posee muchas ventajas sobre los octavos de final de genes y ha sido ampliamente utilizado como una herramienta en los estudios de genes funcionales. La invención de ADN basado en vectores RNAi la tecnología ha hecho a largo plazo y caída de genes inducibles posible, y también aumentó la viabilidad de silenciamiento de los genes En vivo.

Resumen

ARN de interferencia (RNAi) inhibe la expresión de genes de mRNAs objetivo concreto degradantes. Desde el descubrimiento de la doble hélice pequeños ARN de interferencia (siRNA) en el silenciamiento génico ^1, el ARNi se ha convertido en una poderosa herramienta de investigación en los estudios de función de genes. En comparación con la supresión genética, RNAi mediada por silenciamiento de genes posee muchas ventajas, tales como la facilidad con la que se lleva a cabo y su idoneidad para las líneas celulares más. Múltiples estudios han demostrado las aplicaciones de la tecnología RNAi en la investigación del cáncer. En particular, el desarrollo del ADN vector basado en la tecnología para producir pequeña horquilla de ARN (shRNA) impulsado por el promotor U6 o H1 ha hecho a largo plazo y gen inducible silenciar posible ^2,3. Su uso en combinación con la ingeniería genética de vectores virales, como lentivirus, facilita una alta eficiencia de la entrega shRNA y / o la integración en el ADN genómico de expresión estable de ARNhc.

Se describe un detaileProcedimiento D utilizando el vector de ADN basada en la tecnología del RNAi para determinar la función de genes, incluida la construcción de vectores lentivirales que expresan shRNA, la producción y la infección por lentivirus de células, y los estudios funcionales a partir de un modelo de xenoinjerto de ratón.

Varias estrategias se han reportado en la generación de construcciones shRNA. El protocolo descrito aquí empleando amplificación por PCR y una ligadura de 3-fragmento puede ser utilizado para generar directamente y eficientemente ARNhc que contienen construcciones lentiviral sin dejar ningún adyacente nucleótidos extra a una secuencia codificante ARNhc. Puesto que las casetes de expresión ARNhc-creadas por esta estrategia puede ser cortada por enzimas de restricción, que se puede mover fácilmente a otros vectores con diferentes marcadores fluorescentes o un antibiótico. Reactivos de transfección más comerciales se pueden utilizar en la producción de los lentivirus. Sin embargo, en este informe, se proporciona un método económico mediante la precipitación de fosfato de calcio que puede alcanzar más del 90% en la eficiencia de transfecciónCélulas 293T. En comparación con vectores de expresión constitutiva ARNhc, un sistema inducible ARNhc es particularmente adecuado para derribar un gen esencial para la proliferación celular. Se demuestra el silenciamiento de genes de Yin Yang 1 (YY1), un potencial oncogen del cáncer de mama ^4,5, por un Tet-On inducible shRNA sistema y sus efectos en la formación de tumores. La investigación mediante lentivirus requiere de revisión y aprobación de un protocolo de bioseguridad por el Comité de Bioseguridad de la institución de un investigador. La investigación con modelos animales requiere de revisión y aprobación de un protocolo de animales por el Cuidado de los Animales y el empleo (ACUC) de la institución de un investigador.

Protocolo

1. Generación de construcciones shRNA

1. Identificar la secuencia del siRNA-objetivo (20-23 nucleótidos) en base a criterios previamente publicados ⁶ o utilizar un servidor algoritmo basado en la Web, tales como "buscador de siRNA objetivo" de Ambion y GenScript.
2. Sintetizar oligonucleótidos basados ​​en el diseño de secuencias de la Figura 1 y el ejemplo de la Tabla 1. Llevar a cabo la amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos P1 y P2 (de 30 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, hibridación a 60 ° C durante 30 segundos, y alargándose a 72 ° C durante 30 segundos) y un plásmido ....

Discusión

Este protocolo describe un método para derribar un gen utilizando ARNhc y visualizar su efecto biológico usando imágenes bioluminiscente de crecimiento de células tumorales in vivo. El sitio de destino de un ARNhc no debe contener cualquiera de los tres sitios de restricción (BamHI, HindIII y EcoRI) utilizado para la subclonación. En un escenario raro cuando cualquiera de estos sitios está presente, una enzima de restricción adicional puede ser utilizado en su lugar en la generación de la construcción.

Materiales

Además del equipo común de laboratorio utilizado para el ARN y análisis de proteínas y cultivos celulares, los siguientes materiales y reactivos necesarios para este protocolo.

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo
Seguridad de la Biotecnología adecuado para la contención de Bioseguridad Nivel 2 del Gabinete
PCR termociclador
Ultracentrífuga
La anestesia de inducción de la cámara con captadores de isoflurano
Digital vernier
IVIS Imaging System
Altamente competentes E. coli DH5a
EcoRI, BamHI, HindIII y enzimas de restricción
T4 ADN ligasa
La tercera generación de embalaje plásmidos lentivirus VSV-G, pRSV Rev y pMDLg / pRRE

Lista de Materiales