Una baja mortalidad modelo de rata para evaluar vasoespasmo cerebral retardado tras la hemorragia subaracnoidea experimental

Resumen

Hemorragia subaracnoidea aneurismática (HSA) es la hemorragia que se produce en el espacio subaracnoideo cuando un aneurisma se rompe. Mientras que la morbilidad y la mortalidad por este evento ha estado en un declive debido a la mejora de los métodos de tratamiento, el riesgo de vasoespasmo después de la hemorragia subaracnoidea continúa siendo el mismo que era hace unos años. La importancia de establecer un modelo animal completo y reproducible para identificar sucesos iniciadores de vasoespasmo cerebral ha sido el foco de investigación desde el primer uso de ratas en un modelo experimental de vasoespasmo en 1979 por Barry Et al. El trabajo inicial en ratas demostraron que una única inyección de sangre autóloga en la cisterna magna llevó a aguda (en minutos), pero no con retraso vasoespasmo cerebral ^{3, 6, 14}. Aquí caracterizar un modelo de rata de mortalidad baja SAH que da lugar a vasoespasmo retardado reproducible.

Resumen

Objetivo: Caracterizar y establecer un modelo reproducible que demuestre vasoespasmo cerebral retardada después de la hemorragia subaracnoidea por aneurisma (HSA) en ratas, con el fin de identificar los sucesos iniciadores, los cambios fisiopatológicos y objetivos potenciales para el tratamiento.

Métodos: Veintiocho ratas macho Sprague-Dawley (250 - 300 g) se asignaron arbitrariamente a uno de dos grupos - SAH o control de solución salina. Hemorragia subaracnoidea rata en el grupo HSA (n = 15) fue inducida por doble inyección de sangre autóloga, 48 hr aparte, en la cisterna magna. Del mismo modo, la solución salina normal (n = 13) se inyectaron en la cisterna magna del grupo de control de solución salina. Las ratas se sacrificaron en el día cinco después de la inyección de sangre segundos y los cerebros se conservan para el análisis histológico. El grado de vasoespasmo se midió utilizando secciones de la arteria basilar, midiendo el área en sección transversal interna luminal utilizando NIH Image J-software. La significación fueprueba utilizando Tukey / Kramer 's análisis estadístico.

Resultados: Tras el análisis de las secciones histológicas, área luminal de la arteria basilar de la sección transversal fueron más pequeños en la HSA que en el grupo de solución salina, de acuerdo con el vasoespasmo cerebral en el primer grupo. En el grupo de SAH, área basilar arteria interna (0,056 micras ± 3) fueron significativamente más pequeños de vasoespasmo cinco días después de la inyección de sangre segundos (siete días después de la inyección inicial de sangre), en comparación con el grupo control de solución salina con área interna (0,069 ± 3, p = 0,004). No hubo mortalidad de vasoespasmo cerebral.

Conclusión: El modelo de rata doble SAH induce una leve, vasoespasmo de supervivencia, arteria basilar que puede ser usado para estudiar los mecanismos fisiopatológicos de vasoespasmo cerebral en un modelo animal pequeño. Una baja tasa de mortalidad y aceptable es un criterio importante que se cumpla para un modelo animal ideal SAH para que los mecanismos de vasoespasmo puede ser ElucidATED ^{7, 8.} Otras modificaciones del modelo se puede hacer para ajustar por aumento de la severidad del vasoespasmo y exámenes neurológicos.

Protocolo

1. Cirugía para Rat Asunto SAH inyectados con 0,15 ml de sangre autóloga Arterial

1. La rata se anestesia con 0,1 mg / kg de cóctel roedor ketamina / xilazina y se dejó reposar durante 5 min.
2. Anestesia adecuada es confirmado por la reducción de reflejo en la extremidad posterior.
3. Usando una máquina de afeitar electrónico un cuello a la nariz área de pelo alrededor de la región sub-occipital se afeita.
4. El animal se coloca en posición supina sobre la mesa de cirugía y la cola se limpia con betadine para garantizar una incisión estéril.
5. Una regla de 1 cm de la línea media incisión se toma en la cara ventral de la cola
6. La disección se extiende hasta la arteria de la cola es identificado y aislado.
7. El uso de un estéril de calibre 26-catéter, la arteria de la cola se canuló y 0,15 ml de sangre arterial se debe extraer con una jeringa.
8. Una gasa estéril se envuelve alrededor de la incisión para asegurar la hemostasis antes de la aplicación de la Vetbond para sellar la incisión.
9. Tél rata se volvió boca abajo en la mesa y la zona afeitada sobre la región suboccipital se limpió con betadine.
10. El uso de un acceso vertical incisión de línea media se gana a la cisterna magna.
11. Una vez identificada una aguja de calibre 25 se inserta en la cisterna magna y 0,15 ml de líquido cerebroespinal es sacada en una jeringa para evitar el aumento de la presión intracraneal con inyección de volumen de sangre autóloga.
12. Ahora, el 0,15 ml de sangre extraída de la arteria de la cola se inyecta lentamente en la cisterna magna.
13. La aguja se deja en su lugar durante 30 segundos para asegurar la coagulación en el espacio subaracnoideo y luego cuidadosamente retirado.
14. La hemostasia está garantizada, y la incisión se cierra utilizando un dispositivo de grapado.
15. El animal se coloca ahora en decúbito prono sobre una superficie de calentamiento con una cabeza de 20 ° hacia abajo posición durante 20 minutos para permitir que la sangre coagularse en las cisternas alrededor de la arteria basilar.
16. Pasos 1,1 a 1,15 se repiten durante la cirugía segundo 48 horas aparte.

2. Cirugía para Rat Asunto SAH inyectados con solución salina 0,15 ml

1. La rata se anestesia con 0,1 mg / kg de cóctel roedor ketamina / xilazina y se dejó reposar durante 5 min.
2. Anestesia adecuada es confirmado por la reducción de reflejo en la extremidad posterior.
3. Usando una máquina de afeitar electrónico un cuello a la nariz área de pelo alrededor de la región sub-occipital se afeita.
4. El animal se coloca en posición supina sobre la mesa de cirugía y la cola se limpia con betadine para garantizar una incisión estéril.
5. Una regla de 1 cm de la línea media incisión se toma en la cara ventral de la cola
6. La disección se extiende hasta la arteria de la cola es identificado y aislado.
7. El uso de un estéril de calibre 26-catéter, la arteria de la cola se canuló y 0,15 ml de sangre arterial se debe extraer con una jeringa.
8. Una gasa estéril se envuelve alrededor de la incisión para asegurar la hemostasis antes de la aplicación de la Vetbond para sellar la incisión.
9. La rat se gira boca abajo sobre la mesa y la zona de afeitado sobre la región sub-occipital está pintado con betadine.
10. El uso de un acceso vertical incisión de línea media se gana a la cisterna magna.
11. Una vez identificada una aguja de calibre 25 se inserta en la cisterna magna y 0,15 ml de líquido cerebroespinal es sacada en una jeringa y la muestra se almacena.
12. Ahora, el 0,15 ml de solución salina normal (37 ° C) se inyecta lentamente en la cisterna magna.
13. La aguja se deja en su lugar durante 30 segundos y se retira cuidadosamente.
14. La hemostasia está garantizada, y la incisión se cierra utilizando un dispositivo de grapado.
15. El animal se coloca ahora en decúbito prono sobre una superficie de calentamiento con una cabeza de 20 ° hacia abajo posición durante 20 min.
16. Pasos 2,1 a 2,15 se repiten durante la cirugía segundo 48 horas aparte.

3. Rata Sacrificio

1. El día 5 después de la segunda cirugía, las ratas se sacrificaron por perfusión cardiaca.
2. La rata se les administró una dosis letal (00,2 ml / kg) de Fatal Plus (Vortech PHARMACEUTICALS LTD., Dearborn, MI)
3. Con una incisión de línea media vertical, la cavidad abdominal se acercó y el peritoneo se abre.
4. Una toracotomía anterior se lleva a cabo y el corazón está expuesto.
5. El uso de un catéter de calibre 26-conectado con una solución tampón de fosfato (PBS pH 7,4 y en ° 37) el animal se drena de la sangre y después se perfundieron con 4% de paraformaldehído.
6. Después de asegurarse de la adecuada perfusión, la perfusión se detuvo y la rata se lleva a la mesa de decapitación.
7. Después de la decapitación, una gubia ósea se utiliza para eliminar el cráneo para la extracción del cerebro.
8. El cerebro y el tronco cerebral se extraen cuidadosamente de la bóveda craneal y se coloca en una solución de paraformaldehído al 4% y se almacenaron a 4 ° C durante 48 hr.

4. Crear secciones para evaluar Vasoespasmo

1. El cerebro de la rata que ha sido sumergido en 30% de sacarosa durante 4 días se lleva a the criostato para seccionar.
2. Una vez crioprotegidas, 12 secciones mu M se crean utilizando el criostato, con la anterior arteria cerebelosa (AICA) como punto de partida para asegurar la coherencia entre los sujetos.
3. 20 secciones se crean para cada animal, que termina en la arteria cerebelosa superior (SCA).
4. Las secciones se colocan en un portaobjetos de vidrio y se evaluó utilizando la metodología vasoespasmo histológico

Resultados

Dentro de los protocolos descritos anteriormente, hay varios pasos que creemos que requieren una mejor caracterización del modelo de lo que se ha descrito previamente en la literatura. Aquí nos centramos en los pasos que son esenciales para lograr una baja mortalidad reproducible modelo vasoespasmo cerebral pequeño animal y evitar posibles dificultades asociadas con este modelo, si no se hace correctamente.

1. Extracción de sangre autóloga de la arteria de la cola:

...

Discusión

Primates, que tiene una composición genética similar y más características anatómicas de la humana, imitar más de cerca los acontecimientos del vasoespasmo cerebral retardado y es más fácil someterse no invasiva de imágenes (MRI y angiografía) para controlar los cambios arteriales, que los roedores ^8. Sin embargo, los modelos de primates son un costo prohibitivo y se asocia con una atención más compleja y los problemas éticos, que los modelos animales pequeños. Pequeños animales modelos de HSA que se han desa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre de equipo / reactivo	Empresa	Número de catálogo
Ratas SD macho (250-300 g)	Taconic	SD-M
26 g catéteres	Webster	8416683
25 G Agujas	Búfalo	305122
Jeringas de 1 cc	Almacenes centrales	54245
La ketamina / xilazina cóctel	Animal Care (SUNY) *	-
Betadine	Almacenes centrales	51458
Sacarosa	Sigma	S9378-1kg
Paraformaldehído	Sigma	P6148-500G
Solución tampón	Pescador	BP-399-4
Mesa Quirúrgica	Harvard	PY2 72-2590
Octubre Compuesto (crioprotección)	VWR	25608-930
Superfrost Diapositivas	Pescador	12-550-15

* Sintetizado en el Departamento de Cuidado de Animales de Laboratorio, SUNY Upstate Medical University. Añadir 1 cc [100 mg / ml] de Xilazina a 10 ml [100 mg / ml] de ketamina.