Artículo de método

Perfiles Integral del Reglamento de la dopamina en la sustancia negra y el área tegmental ventral

DOI:

10.3791/4171

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10 de agosto de 2012

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Toxicology, & Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center

En este artículo

Resumen

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La dopamina está claramente regulado en los núcleos del cerebro medio, que contiene la celda de los cuerpos y las dendritas de las neuronas de dopamina. Aquí se describe un método de disección y manejo de la muestra-para maximizar los resultados, y por lo tanto las conclusiones y puntos de vista, sobre la regulación de la dopamina en el núcleo del cerebro medio de la sustancia negra (SN) y el área tegmental ventral (VTA) en los roedores.

Resumen

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La dopamina es un neurotransmisor con fuerza estudió en el SNC. De hecho, su participación en la actividad locomotora y la conducta relacionada con la recompensa ha promovido cinco décadas de investigación sobre las deficiencias moleculares asociados con la regulación de la dopamina. La mayoría de estas investigaciones de la regulación de la dopamina en el centro del cerebro sobre la base molecular para su regulación en las regiones terminales de campo de las vías y nigroestriatales mesoaccumbens, cuerpo estriado y núcleo accumbens. Además, estos estudios se han concentrado en el análisis del contenido de tejido dopamina con la normalización de peso sólo tejido húmedo. La investigación de las proteínas que regulan la dopamina, como la tirosina hidroxilasa (TH) de proteínas, la fosforilación de TH, transportador de dopamina (DAT), y el transportador vesicular de monoaminas 2 (VMAT2) de proteínas a menudo no incluyen el análisis de contenido de tejido de la dopamina en la misma muestra. La capacidad de analizar tanto el contenido de tejido dopamina y sus proteínas reguladoras (incluyendo el post-TRAmodificaciones nslational) no sólo le da el poder inherente a la interpretación de la relación de la dopamina con el nivel de proteínas y la función de TH, DAT, o VMAT2, sino que también se extiende a la economía de la muestra. Esto se traduce en un menor costo, y sin embargo, produce ideas sobre la regulación molecular de la dopamina en prácticamente cualquier paradigma de la elección de los investigadores.

Nos centramos el análisis en el cerebro medio. Aunque el SN y VTA son típicamente descuidado en la mayoría de los estudios de regulación de dopamina, estos núcleos son fácilmente disecados con la práctica. Una lectura completa del contenido de los tejidos la dopamina y la TH, DAT, o VMAT2 puede llevarse a cabo. Existe un creciente literatura sobre el impacto de la función de la dopamina en el VTA SN y en el comportamiento y las Tropezaciones de sustancias exógenas o procesos de enfermedades en ellos 1-5. Además, los compuestos tales como factores de crecimiento tiene un profundo efecto sobre las proteínas de dopamina y la dopamina-regulación, en un grado relativamente mayor en el SN o VTA Vamos a ilustrar la técnica de disección para separar estos dos núcleos y el procesamiento de la muestra de tejido disecado que produce un perfil de revelar los mecanismos moleculares de regulación de dopamina in vivo, específicos para cada núcleos (Figura 1).

Protocolo

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1. Disección

  1. Sobre un lecho de hielo húmedo, enfriar una matriz de cerebro de roedores (cortes coronales separados 1 mm de diferencia), una placa de Petri que contiene 5 hojas de afeitar, y un bisturí # 11. En un recipiente separado, lugar marcado 2 ml tubos de microfuga de tamaño en hielo seco.
  2. El investigador elegirá el método de la eutanasia. Tenemos resultados reproducibles realización de una anestesia con isoflurano muy breve, idealmente, un vaporizador debe ser utilizado. Sin embargo, si no está disponible, se utiliza un frasco que contiene una batería de gran tamaño de la plataforma. Con el frasco de la batería situada en una campana de ve....

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Discusión

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Como se indica en la Figura 1, los métodos detallados anteriormente deben producir lecturas múltiples de dopamina y su TH proteínas reguladoras, DAT, y VMAT2 de una muestra de SN o VTA obtenerse a partir de la rata o el ratón. Una vez más, los beneficios de la realización de este protocolo es que el investigador puede obtener lecturas operativamente con ajuste de cómo se regula la dopamina in vivo bajo virtualmente cualquier paradigma experimental y, al hacerlo, ahorrar considerables recursos experimentales med.......

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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El financiamiento para el trabajo de este, y 2,10, como se cita, fue proporcionada, en parte, por unos premios de investigación de subvención a Salvatore MF de la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento, el Edward P. Stiles Fondo Fiduciario y la Fundación para la Investigación Biomédica del Noroeste de Louisiana, y BS Pruett de la beca predoctoral Muslow Ike, LSU Health Sciences Center-Shreveport.

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Materiales

Sistema de HPLC:

El sistema básico consiste en un Shimadzu LC10-ADVP bomba HPLC, Waters WISP un 717 inyector automático de muestras, de 250 X 4,4 mm 5 micras Spherosorb SAO-1 C18 columna de fase inversa (Waters), un Bioanalytical Systems (BAS) TL12 de doble cristalino electrodo de carbón, dos detectores de BAS LC4B electroquímicas, y las aguas de un Empower 2 de recopilación de datos e integración de sistemas.

La columna se mantiene a 30-45 ° C (BAS calentador columna LC22A). La fase móvil es fosfato de sodio 0,1 M (pH 3,0), 0,1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-octano sulfónico (Eastman-Kodak), y 0,35% de acetonitrilo (v / v), se filtró a través de un filtro de 0,45 micras. El caudal es de 1,2 ml / min. Cuatro lotes litros de fase móvil están optimizados para las separaciones por ajuste del pH, octano ácido sulfónico y temperatura de la columna. La fase móvil se recicla, y se purgó continuamente con gas helio para eliminar el oxígeno disuelto. El reciclado de la fase móviles casi imprescindible para mantener una buena resolución para un período de tiempo razonable. La fase móvil la vida útil se mantiene mediante el uso de un interruptor de flujo (controlada por el integrador) para desviar a perder el primero 2-7 minutos de cada carrera.

Los electrodos se mantienen a potenciales de aproximadamente 0,78 y 0.95V con respecto a un electrodo de referencia Ag/AgC1. El electrodo en el potencial más alto se utiliza exclusivamente para la determinación de triptófano (y el estándar de NMDA interna). El potencial de 0,78 V proporciona una señal superior a ruido para la detección de las monoaminas y compuestos, excepto triptófano. Los cromatogramas se almacenan en el disco duro de la estación de trabajo Empower, y posteriormente se procesa y transfiere los datos directamente en una hoja de cálculo Excel para el cálculo de las cantidades de metabolitos y la compilación de datos del grupo.

Bomba: Shimadzu LC-10AD
Celular: BAS flujo cruzado. Carbono vidrioso electrodo de trabajo a 0,780 y 0,9Potencial V 50.
Detector: BAS LC-4B, que opere en modo de doble canal.
Los datos Adq. Sistema: Aguas Empower Pro 2.
Inyector: 717 WISP Waters
Columna: Aguas Spherosorb SAO-1, ​​5 mM de partícula, 4,4 mm x 250 mm.

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo
Dodecilsulfato sódico (SDS) - JT Baker 4095-02
Trizma Base Sigma T1503-1kg
Trizma HCl Sigma T3253-1kg
Glicerol Sigma G8773-500 ml
PVP-40 Sigma PVP40-1kg
DPBS Gibco 21600-069
Tween 20 Sigma P1379-500 ml
Glicina Sigma G8898-1kg
Ponceau S Fluka 81460
Azul de bromofenol Sigma B8026-5G
Ditiotreitol Sigma D-9163
Proteína estándar 2 mg de BSA Sigma P5619-25VL
Pierce BCA Protein ensayo Reactivo A Thermo Fisher Scientific- 23223
Precision Plus estándar Proteína Bio Rad 161-0373
[125I]-proteína A, la actividad específica Perkin-Elmer

Tabla 2. Reactivos específicos.

Reactivos Fórmulas
10% de SDS 10 g de SDS, 100 ml de H 2 0
SDS al 1% (pH 8,2)
  1. 10 ml10% de SDS
  2. 60,5 mg de base Trizma
  3. 37,22 mg de EDTA
  4. 90 ml de H 2 0
Cobre II solución de sulfato
  1. 1 g de cobre II sulfato de
  2. 25 ml de H 2 0
Tampón de muestra 3X
  1. Trizma base 2,27 g
  2. SDS 6 g
  3. Ditiotreitol 0,463 g
  4. Glicerol 30 g
  5. 10 mg de azul de bromofenol
  6. DIH 2 0 (añadir inicialmente por encima de los reactivos a 40 mL de H 2 0 en un cilindro graduado, a continuación, agregar H 2 0 hasta que el volumen llegue a 100 ml)
  7. HCl (añadir según sea necesario para alcanzar un pH de 6,85)
  8. Congelar solución en 50 tubos de 2,0 ml.
(Hace 100 ml): Volumen de tampón de muestra 3X necesario = volumen de la mitad de SDS utilizado en la muestra.
1X tampón de muestra Diluir tampón de muestra 3X abajo a 1X tampón de muestra utilizando DI H 2 0
10 veces Funcionamiento de amortiguación (Rinde 4 L)
  1. Trizma base 121,1 g
  2. La glicina 577 g
  3. 40 g de SDS
Tampón de transferencia 10 veces: (para 4 L)
  1. La glicina 360 g
  2. Trizma base 96 g
Ponceau
  1. Ponceau S. 0,5 g
  2. Ácido acético 5 ml
  3. DI H 2 0 95 ml
0,2% solución de HCl 5,2 ml de HCl en 500 ml de H 2 0
PVP-T20 bloqueo Soln. (Hace 4 L)
  1. PVP-40 40 g
  2. DPBS 38,2 g
  3. Tween20 2 g
  4. Timerisol 0,4 g
  5. 1M Tris pH 7,6 (60,6 g de Tris HCl + 13,9 g de Tris base en 500 ml de H DI 2 0) - 50 ml
Buffer 10X Blot (Rinde 4 L)
  1. Tween 20 20 g
  2. Tris Base 14 g
  3. Tris-HCl 61 g
CONTENIDO "> la Tabla 3. de ensayo de proteínas y Western Blotting fórmulas.

Las normas de la tirosina hidroxilasa TH: Los calibrados los estándares y la fosforilación de proteínas utilizadas por este laboratorio se derivan de extractos de células PC12, que se analizaron el contenido de proteína TH y estequiometría de fosforilación de las normas en contra de un TH previamente calibrados que en última instancia se originaron en el laboratorio del Dr. John Haycock 11 .

Referencias

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  1. Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
  2. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C.

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