Proteínas de unión de hielo (IBP), también conocidas como proteínas anticongelantes, inhibir el crecimiento del hielo y son un aditivo prometedor para su uso en la crioconservación de tejidos. La principal herramienta utilizada para investigar los IBP es el osmómetro nanolitros. Hemos desarrollado un hogar diseñado etapa de enfriamiento montado en un microscopio óptico y se controla utilizando una rutina de costumbre-construido LabVIEW. El osmómetro nanoliter descrito aquí manipulado la temperatura de la muestra de una manera ultra-sensible.
Artículo de método
LabVIEW operado Novela Osmometer nanolitros de Investigaciones de hielo de fijación con proteínas
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Resumen
Resumen
Las proteínas de unión al hielo (IBPs), incluyendo las proteínas anticongelantes, proteínas estructurantes del hielo, proteínas de histéresis térmica y proteínas inhibidoras de la recristalización del hielo, se encuentran en organismos adaptados al frío y los protegen de lesiones por congelación mediante la interacción con cristales de hielo. Las IBPs se hallan en una variedad de organismos, incluyendo peces1, plantas2, 3, artrópodos4, 5, hongos6 y bacterias7. Las IBPs se adsorben a las superficies de los cristales de hielo y evitan que las moléculas de agua se incorporen a la red cristalina del hielo en los lugares donde se han adsorbido las IBPs. El hielo que crece sobre la superficie del cristal entre las IBPs adsorbidas desarrolla una alta curvatura que reduce la temperatura a la cual crecen los cristales de hielo, un fenómeno conocido como efecto Gibbs-Thomson. Esta depresión crea una brecha (histéresis térmica, TH) entre el punto de fusión y el punto de congelación fuera del equilibrio, dentro de la cual el crecimiento del hielo se detiene8-10, véase Figura 1. Una de las herramientas principales utilizadas en la investigación de IBPs es el osmómetro de nanolitros, que facilita la medición de la actividad de TH en soluciones de IBPs. Los osmómetros de nanolitros, como el instrumento Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY) y el instrumento Otago (Otago Osmometers, Dunedin, Nueva Zelanda), fueron diseñados para medir la osmolaridad de una solución midiendo la depresión del punto de fusión de gotas con volúmenes del orden de los nanolitros. Estos dispositivos se utilizaron para medir las osmolaridades de muestras biológicas, como las lágrimas11, y se descubrió que eran útiles en la investigación de IBPs. El control manual de estos osmómetros de nanolitros limitaba las posibilidades experimentales. No era posible controlar de forma fiable los cambios en la velocidad de temperatura, el rango térmico del instrumento Clifton estaba limitado a 4.000 mOsmol (aproximadamente -7,5 °C), y la grabación de la temperatura en función del tiempo no era una opción disponible en estos instrumentos.
Diseñamos un sistema personalizado de osmómetro de nanolitros controlado por computadora utilizando una plataforma LabVIEW (National Instruments). La platina fría, descrita previamente9, 10, contiene un bloque metálico a través del cual circula agua, actuando así como un disipador de calor, véase Figura 2. A este bloque van fijados enfriadores termoeléctricos que pueden ser accionados mediante un controlador de temperatura comercial que se puede manejar a través de módulos LabVIEW, véase Figura 3. Se proporcionan más detalles a continuación. La principal ventaja de este sistema es su control de temperatura sensible, véase Figura 4. El control automatizado de la temperatura permite coordinar una rampa de temperatura fija con una salida de microscopía de video que contiene detalles experimentales adicionales.
Para estudiar la dependencia temporal de la actividad TH, probamos una IBP hipercativa de 58 kDa procedente de la bacteria antártica Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. Esta proteína fue marcada con proteínas fluorescentes verdes mejoradas (eGFP) en un constructo desarrollado por el grupo de Peter Davies (Universidad de Queens)10. Demostramos que el perfil de cambio de temperatura afectaba la actividad TH. Un excelente control sobre el perfil de temperatura en estos experimentos mejoró significativamente las mediciones TH. El osmómetro de nanolitros además nos permitió evaluar la inhibición de recristalización de las IBP5, 13. En general, la recristalización es un fenómeno en el cual los cristales grandes crecen a expensas de los cristales más pequeños. Las IBP inhiben eficazmente la recristalización, incluso a bajas concentraciones14, 15. Utilizamos nuestro osmómetro controlado mediante LabVIEW para seguir cuantitativamente la recristalización del hielo y para mantener una fracción constante de hielo mediante un análisis en tiempo real simultáneo de las imágenes y retroalimentación de temperatura procedente de la cámara de muestra13. Los cálculos en tiempo real ofrecen opciones adicionales de control durante un procedimiento experimental. Se desarrolló una platina para microscopio invertido para acomodar dispositivos microfluídicos con control de temperatura, los cuales serán descritos en otro lugar16.
El sistema de platina fría
El conjunto del platillo frío (Figura 2) consta de un conjunto de enfriadores termoeléctricos que enfrían una placa de cobre. El calor se elimina del platillo haciendo circular agua fría a través de un compartimento cerrado situado debajo de los enfriadores termoeléctricos. Un orificio de 4 mm de diámetro en el centro de la placa de cobre sirve como ventana de observación. Se perforó un orificio plano de 1 mm de diámetro para alojar el termistor. Un disco de cobre fabricado a medida (7 mm de diámetro) con varios orificios (500 μm de diámetro) se colocó sobre la placa de cobre y se alineó con la ventana de observación. Se bombeó aire a un caudal de 35 ml/seg y se secó utilizando Drierite (W.A. Hammond). El aire seco se utilizó para garantizar un ambiente seco en el platillo de enfriamiento. El platillo se conectó mediante un conector de 9 pines a un controlador de temperatura (Modelo 3040 o 3150, Newport Corporation, Irvine, California, EE. UU.). El controlador de temperatura se conectó mediante un cable a una tarjeta GPIB-PCI de computadora (National Instruments, Austin, Texas, EE. UU.).
Protocolo
0. Procedimientos preliminares
- Capilar de vidrio para inyección solución. Usando un extractor capilar (Narishige, Tokyo, Japón), preparar una pipeta agudo con una abertura fina de un tubo capilar de vidrio micro (Marca GMBH, Wertheim, Alemania). El tamaño de la abertura debe ser verificada haciendo pasar aire a través del capilar para obtener burbujeo fino en agua limpia. Si el capilar se cierra, entonces se puede abrir rompiendo su borde. Esto puede conseguirse pulsando o rascarse suavemente contra el agua que contiene paredes de los tubos. Preparar el capilar tal que la abertura está casi bloqueado, pero es lo suficientemente abierto para permitir la formación de burbujas de menos de un milímetro.
- Limpieza Cobre disco. Sonicar los discos de cobre durante 10 minutos en 0,1% Micro-90 jabón (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, EE.UU.), luego lavar con agua doblemente destilada. Introducir los discos en una mezcla de isopropanol (técnico) y sonicar solución de nuevo durante 10 min. Aletaaliado, se secan los discos con aire filtrado. Esta etapa de limpieza es crítica para evitar la contaminación IBP entre los experimentos.
- Doble capa de montaje cubreobjetos. Un conjunto de cubreobjetos se preparó para permitir la observación de la muestra sin condensación de humedad sobre la superficie de vidrio cubierta. Esto se logró mediante la colocación de un Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, EE.UU.) partícula (2 mm de diámetro) entre dos cubreobjetos que fueron pegados a continuación con una pistola de pegamento caliente. Esta configuración impide la condensación que podría bloquear la vista cuando la muestra se enfrió a bajas temperaturas y elimina la necesidad para soplar aire seco a la ventana de observación.
1. Etapa de enfriamiento Set-up
- Conectar la entrada de flujo de agua y la salida de la etapa de enfriamiento a 4 mm de diámetro interno Tygon tubos (Saint-Gobain, París, Francia), y conecte el flujo de agua del tubo de entrada a una bomba de agua.
- Conectar un tubo de 4 mm interior Tygon diámetro a la entrada de la etapa de enfriamiento to suministrar aire seco. El aire se secó usando una columna en línea de Drierite.
- Operar las bombas de aire y agua. Tenga en cuenta que los elementos de refrigeración no debe funcionar sin un disipador de calor.
- Encienda el controlador de temperatura, cámara, y la rutina de LabVIEW.
2. Preparación de la muestra
- Colocar una gota de 3-4 l de aceite de inmersión B (Cargille laboratorios, Cedar Grove, Nueva Jersey, EE.UU.) en el lado posterior de un disco de diámetro de cobre de 7 mm que tiene 500 agujeros perforados mu m a través del disco.
- Colocar el disco de cobre en la etapa de enfriamiento con el lado del aceite de inmersión hacia abajo.
- Conectar el tubo capilar (el borde romo) a un 0,7 mm de diámetro interior del tubo Tygon conectado en el otro extremo a una jeringa de 2 ml, de vidrio (Poulten-Graf, Wertheim, Alemania).
- Antes de utilizar el tubo capilar, visita de la pequeña abertura de la capilaridad para asegurar que la abertura es un tamaño apropiado (véase los procedimientos preliminares).
- Inserte lentamente la glass capilar en el tubo de muestra preparada IBP proteína (2,4 mM Mp IBP-GFP en 20 mM de CaCl 2 y 25 mM Tris-HCl a pH 8, véase la referencia 10 para los detalles de preparación) y tirar de la jeringa de vidrio hasta que el capilar de vidrio contiene 0,1 l de la solución de proteína.
- Comienza la grabación de vídeo a través del software LabVIEW.
- Insertar el borde afilado de la capilar de vidrio (que contiene la solución de proteína) en uno de los agujeros en el disco de cobre en la etapa de enfriamiento.
- Mientras observa a través del microscopio (Olympus, Tokio, Japón, objetivo 10x), cuidadosamente penetrar en la capa de inmersión en aceite con la punta capilar de vidrio, y presione la jeringa de vidrio (muy delicadamente) para suministrar una cantidad pequeña (~ 10 nl) de la proteína solución para crear una gotita 200 micras.
- Cubrir el agujero en la etapa de enfriamiento con el conjunto de capa doble cubreobjetos (véase los procedimientos preliminares).
3. TH de medición de actividad
- Press el botón de refrigeración y la temperatura a -40 ° C.
- Inicialmente, la gota de solución será clara. A temperaturas bajas, típicamente en el rango de -30 ° C a -35 ° C, el color gotita cambios, lo que indica que la solución ha sido congelado. Inmediatamente después de la muestra se ha congelado, aumentar la temperatura lentamente hasta que la mayor parte de hielo comienza a derretirse. Un aumento gradual de la temperatura es necesario para evitar el rebasamiento de la temperatura que podría resultar en la fusión completa de la muestra.
- Cambiar a un objetivo 50x y comienzan a fundir el hielo mediante el ajuste de la temperatura. Este ajuste es interactivo, y los pasos finales se realiza normalmente con pequeños pasos de temperatura de 0,002 ° C. Continúe hasta que se derrita un cristal único que queda. El tamaño final del cristal debe ser alrededor de 10 micras. La temperatura más alta a la que ha dejado de fusión se determina que el punto de fusión y se determina con precisión en la etapa de análisis de vídeo más tarde.
- Ajustar la temperatura a unas pocas centésimas de un grado centígrado por debajo del punto de fusión del cristal y comenzar una rampa de temperatura con un retraso de 10 min. Ajustar la velocidad de rampa según se desee. Durante este tiempo, el cristal estará expuesto a los IBP.
- Al finalizar el tiempo de 10 min de exposición, la temperatura disminuirá de forma automática bajo el control de la rutina de LabVIEW.
- Observar la forma de los cristales a medida que disminuye la temperatura. En algún momento, la ráfaga repentina de los cristales de hielo pueden ser observados. La temperatura a la que ocurre esto se observa como la temperatura ráfaga cristal.
- El uso de análisis de vídeo para determinar el punto de fusión y la temperatura precisa de ráfaga. En primer lugar, mediante el uso de análisis de vídeo, encontrar el punto de fusión exacto. Recordemos que la temperatura más alta a la que ha dejado de fusión se determina que el punto de fusión. Documentar este punto de fusión en un programa de hoja de cálculo. Entonces, determinar la temperatura exacta cristal ráfaga, y documentar este valortambién. La diferencia entre el punto de fusión y el punto de congelación, o la temperatura ráfaga de cristal, es la actividad de histéresis térmica de la solución de IBP.
4. Medida de la actividad TH en función del tiempo
- Seguir el protocolo descrito en las Secciones 3.1-3.3 para preparar un solo cristal de hielo.
- Después de la formación de los cristales, ajuste el tiempo de retardo de la rampa como desee y, a su vez en la rampa.
- La temperatura disminuye a una tasa fija (de acuerdo con los requisitos de los operadores) de forma automática una vez que el tiempo de retardo de rampa ha pasado.
- Documentar la temperatura a la que se produce la ráfaga de cristal. Calcular el tiempo de exposición (el tiempo entre la formación de cristales y la ráfaga de cristal).
- Repetir el experimento para tiempos de retardo diferentes y representar gráficamente la actividad TH como una función del tiempo de exposición para evaluar la dependencia del tiempo de la actividad TH.
Resultados
La medición de la dependencia del tiempo TH
El osmómetro LabVIEW operado nanolitros facilita la realización de mediciones precisas de la actividad TH. La tasa de reducción de temperatura constante permite la medición de la dependencia del tiempo TH. El control preciso de la temperatura activado por el osmómetro de nanolitros era crucial para estos experimentos. El tiempo de exposición de un cristal de hielo a los IBP en solución se define como el periodo de tiempo desde la formación del cristal (el final del proceso de fusión) hasta que el crecimiento repentino de hielo alrededor del cristal (cristal ráfaga). Se encontró que el tiempo de exposición de los cristales de hielo a los IBPs afectado de forma crucial la actividad TH. Los períodos cortos de exposición a IBP (unos pocos segundos) produjo una actividad TH baja en el Mp IBP-GFP solución (2,4 mM) (Figura 5). La actividad TH aumentó con el tiempo de exposición IBP hasta que alcanzó una meseta a 4 min de exposición IBP. A concentraciones más altas de IBP, la placaau se alcanzó a los tiempos más cortos.
Figura 1. IBPs diagrama esquemático que ilustra adsorbido en hielo. Aprobada con permiso de 10.
Figura 2. La etapa de enfriamiento. A) conectado a los tubos en el microscopio. B) Sin el liderazgo superior. C) Diagrama esquemático.
Figura 3. Captura de pantalla de la interfaz de LabVIEW. Click aquí para ampliar la figura.
Figura 4. Gráfico de temperatura estabilidad. El controlador de temperatura se ajustó a bajar la temperatura de 0,01 ° C cada 15 seg.
Figura 5. Mp actividad TH IBP como una función del tiempo de exposición de cristales de hielo a los IBP. Cada punto de tiempo es la media de 3-6 experimentos.
Discusión
Este trabajo demuestra el funcionamiento de un osmómetro de nanolitros controlado por computadora que permite mediciones precisas de la actividad TH con control de temperatura extraordinaria. En cualquier sistema sensible a la temperatura, gradientes de temperatura no deseados deben ser evitados. Para evitar gradientes de temperatura en el aparato que aquí se presenta, la gota de solución de ensayo debe ser posicionado en el centro de un agujero en la etapa de refrigeración de cobre del disco (paso 2,7). Adicionalmente, el monocristal debe estar en el centro de la gotita en lugar de cerca de los bordes (en la mayoría de los casos, esto sucederá de forma espontánea). La dependencia del tiempo descrito indica que la velocidad de enfriamiento puede influir en las lecturas de TH. Por lo tanto, se sugiere incluir un informe del tiempo durante el cual el cristal fue expuesta a la solución antes de la refrigeración, así como la velocidad de enfriamiento. Normalmente nos esperó 10 min antes de la rampa descendente de la temperatura a 0,01 ° C pasos cada sec 4.
Los co-LabVIEW controladosetapa Oling fue adaptado para uso con un microscopio invertido en el que los dispositivos de microfluidos podría ser térmicamente manipulado. Este sistema facilita la realización de experimentos de intercambio de soluciones que implican cristales de hielo y IBPS etiquetados con eGFP 9, 10, 16. El sistema LabVIEW controlado puede ser adaptado a una etapa Clifton conectando el controlador de temperatura 3040 a través de un circuito de adaptación designado eléctrica. Tal sistema es operado en el laboratorio Davies 17. El software LabVIEW y el diseño de la adaptación designado circuito eléctrico para la etapa de Clifton están disponibles bajo petición.
En conclusión, se describe un osmómetro de nanolitros que facilita el control sensible y manipulación de la temperatura y la tasa de aumento de la temperatura y disminución (con 0,002 ° C sensibilidad), coordinado con un interfaz de vídeo a través de una rutina de LabVIEW para análisis en tiempo real. Este sistema puede realizar reproducibles de velocidad controlada experimentos que son Important para investigar la cinética de la interacción IBP con hielo. Tales experimentos pueden abordar varios largamente debatido cuestiones relacionadas con el mecanismo de acción de los IBP.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por la ISF, NSF, y ERC. Queremos reconocer la ayuda técnica con la etapa de temperaturas de Randy Milford, Michael Koren, Shafer Doug y Jeremy Dennison. Asistencia en el desarrollo de software fue proporcionado por O Chen, Xu Di, Sannareddy Rajesh, y Bhattachary Sumit. Nos gustaría agradecer a nuestros colaboradores el profesor Peter L. Davies y el Dr. Laurie A. Graham para la proteína de fusión IBP y útiles debates. También queremos agradecer a los miembros del laboratorio del Dr. Maya Bar-Dolev, Qin Yangzhong, Dr. Yeliz Celik, el Dr. Natalya Pertaya, Mizrahy Ortal, y Guy Shlomit por su retroalimentación de los usuarios.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre | Empresa | Número de catálogo / modelo | Comentarios |
| Aceite de inmersión tipo B | Cargille Laboratorios | 16484 | |
| Drierite | WA Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 solución de limpieza | Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
| Capilar extractor | Narishige | PB-7 | |
| Tubos capilares de cristal | Marca GnbH Persona | 7493 21 | 75 mm de largo, 1,15 de diámetro |
| Temperaturacontrolador | Newport, Irvine, California, Estados Unidos | Modelo 3040 | Modelo 3040 |
| Microscopio de luz | Olimpo | Modelo BH2 | |
| Objetivo de 10x | Olimpo | S Plan 10, 0,3, 160/0.17 | |
| Objetivo 50x | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| Cámara CCD | Provideo | CVC-140 | |
| Tubos Tygon | Saint-Gobain, París, Francia | Formulación Tygon S-50-HL Tubería | |
| Vidrio de la jeringa (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Alemania | 7 10227 | |
| Tarjeta PCI GPIB- | National Instruments, Austin, Texas, EE.UU. | 778032-01 | |
| Vídeo marco grabBER IMAQ PCI-1407 | National Instruments, Austin, Texas, EE.UU. | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Software Design | National Instruments, Austin, Texas, EE.UU. | Versión 8 | |
| Software DivX Author | DiVx LLC, San Diego, CA, EE.UU. |
Referencias
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