Para purificar de cigotos S. cerevisiae, Las células haploides de tipo de apareamiento opuesto fueron diseñados para expresar proteínas fluorescentes rojas o verdes, co-incubadas para permitir la formación de cigoto, y se fraccionó utilizando una citometría de flujo basado en el protocolo. La fracción altamente enriquecida permite subsiguiente "-ómicas" los estudios, la recuperación de la progenie inicial y la investigación sistemática de la morfogénesis cigoto.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Citometría de flujo basado Purificación de
En este artículo
Resumen
Resumen
Los cigotos son intermediarios esenciales entre haploides y diploides estados en el ciclo de vida de muchos organismos, incluyendo la levadura (Figura 1) 1. S. cerevisiae cigotos resultado de la fusión de células haploides de tipo de apareamiento diferente (MATa, MATalpha) y dan lugar a las correspondientes diploides estables que, sucesivamente, generar tantos como 20 progenie diploide como resultado de sus divisiones mitóticas sorprendentemente asimétricos 2. Formación de cigoto está orquestada por una compleja secuencia de eventos: En este proceso, los factores solubles de acoplamiento se unen a los receptores cognados, provocando mediadas por el receptor cascadas de señalización que facilitan la interrupción del ciclo celular y culminan en la fusión célula-célula. Los cigotos se puede considerar un modelo para progenitor o función de células madre.
Aunque se ha aprendido mucho acerca de la formación de cigotos y aunque cigotos se han utilizado para investigar las células moleculares preguntas de interés general sigicance, casi todos los estudios han hecho uso de mezclas de apareamiento en el que los cigotos se entremezclan con una mayoría de la población de células haploides 3-8. Muchos aspectos de la bioquímica de la formación del cigoto y la vida continua del cigoto por lo tanto permanecen sin investigar.
Informes de purificación de cigotos levadura describir protocolos basados en sus 9 unidades de sedimentación, sin embargo, este procedimiento sedimentación basada no cedió casi un 90% de pureza en nuestras manos. Además, tiene la desventaja de que las células se exponen a hipertónica sorbitol. Por lo tanto hemos desarrollado un procedimiento de purificación versátil. Para este propósito, pares de células haploides que expresan proteínas fluorescentes rojas o verdes se co-incubaron para permitir la formación de cigoto, se recogieron en diversos momentos, y los zigotos resultantes se purificaron utilizando una citometría de flujo basada en protocolo de clasificación. Esta técnica proporciona una evaluación conveniente visual de la pureza y la maduración. La pureza mediade la fracción es de aproximadamente 90%. De acuerdo con el momento de la cosecha, los cigotos de diferentes grados de madurez se puede recuperar. Las muestras purificadas proporcionar un punto conveniente de partida para "-ómicas" estudios, para la recuperación de la progenie inicial, y para la investigación sistemática de esta célula progenitora.
Protocolo
1. Crecimiento célula haploide
- Crecer S. células de Saccharomyces desde el fondo S288C (BY4741) bajo condiciones estándar 10.
- Transformar haploides para expresar cualquiera de los dos marcadores fluorescentes visibles 10. Los marcadores de elección son GFP soluble expresada en el citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado con BglII 11) y una proteína ribosómica único, RPL25, fusionado con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Esperamos que los equivalentes de dos colores protocolos de purificación podría hacer uso de otras proteínas fluorescentes brillantes que son sintetizados por las célu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La disponibilidad de los cigotos purificados debería facilitar los estudios bioquímicos incluyendo transcriptómica, proteómica y lipidómica, así como la investigación de los mecanismos por los cuales se someten a cigotos ciclo celular de re-entrada, la remodelación de la pared celular, características de florecimiento y la herencia, etc Alternativamente, los cigotos se podría generar a partir con cepas portadoras de mutaciones características en uno o ambos padres. Además, los cigotos purificados, como para células hapl.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. R. Michael Sramkoski ayuda con la citometría de flujo, el Dr. Purnima Jaiswal y el Dr. Wu Di de entrada temprano y Aylyarov Ilya ayuda con las ilustraciones. Apoyado por el NIH Grant R01GM089872 y la Citometría y Microscopia de imágenes facilidad de la base de la sentencia de Centro Integral del Cáncer (P30 CA43703).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo / Equipo | Fuente | Número de catálogo | |
| pEG220, URA3/YIp, que codifica GFP citoplasmática 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, RPL25 codificación fusionado a mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicador | Fisher Scientific | ||
| Polipropileno tubo con tapa colador | BD Falcon | Ref. 352235 | |
| Microcentrífuga refrigerada | Tomy | MRX-150 | |
| La citometría de flujo vaina solución | Biosure | 1027 | |
| Reflexión iCyt Modelo Citometría de Flujo | Sony | ||
| DeltaVision deconvolución microscopio | Applied Precision | ||
| Microscopio de epifluorescencia vertical | Leica | ||
| UltraPure agarosa | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM formulación glucosa Notas: Para las placas de agar, simplemente incluyen 2% de agar (Difco) | 10 |
Referencias
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
