La purificación y la agregación de la proteína precursora amiloide del dominio intracelular

Resumen

Un método para la purificación a gran escala del dominio intracelular de APP (AICD) se describe. También describe la metodología para inducir In vitro AICD agregación y visualización por microscopía de fuerza atómica. Los métodos descritos son útiles para la caracterización bioquímica / estructural de la AICD y los efectos de las chaperonas moleculares en su agregación.

Resumen

Proteína precursora de amiloide (APP) es una proteína transmembrana de tipo I asociado con la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (AD). APP se caracteriza por un gran dominio extracelular y un dominio citosólico corto denominado el dominio intracelular de APP (AICD). Durante la maduración a través de la vía secretora, APP puede ser escindida por proteasas denominadas α, β, y γ-secretasas ^1. La escisión proteolítica de APP secuencial con β y γ-secretasas conduce a la producción de un péptido pequeño proteolítica, Aß denomina, que es amiloidogénica y el constituyente principal de las placas seniles. La AICD también es liberado de la membrana después de la elaboración secretasa, y a través de las interacciones con Fe65 y Tip60, puede trasladar al núcleo de participar en la regulación de la transcripción de genes diana múltiples ^2,3. Interacciones proteína-proteína que implican la AICD pueden afectar el tráfico, el procesamiento y las funciones celulares de holo-APP y su C-terminfragmentos col. Recientemente hemos demostrado que puede AICD agregado in vitro, y este proceso se inhibe por la ubiquitina-1 AD-implicado chaperona molecular ^4. Consistente con estos hallazgos, la AICD ha expuesto dominios hidrófobos y está intrínsecamente desordenados in vitro ^5,6, sin embargo se obtiene una estructura secundaria estable cuando está unido a Fe65 ^7. Hemos propuesto que la ubiquitina-1 previene apropiado interacciones inter-e intramolecular de la AICD, prevenir la agregación in vitro y en células intactas ^4. Mientras que la mayoría de los estudios se centran en el papel de APP en la patogénesis de la EA, el papel de la AICD en este proceso no está claro. Expresión de AICD se ha demostrado que induce la apoptosis ^8, para modular las vías de señalización ^9, y para regular la señalización de calcio ^10. La sobreexpresión de la AICD y Fe65 en un modelo de ratón transgénico induce patología de Alzheimer como ^11, y recientemente AICD se ha detectado en el sujetadoren lisados ​​por Western Blot utilizando las técnicas apropiadas de recuperación de antígeno ^12. Para facilitar estudios estructurales, bioquímicos y biofísicos de la AICD, se ha desarrollado un procedimiento para producir cantidades grandes de proteína recombinante AICD altamente puro. Nos describen además un método para inducir la agregación en vitro térmica de AICD y el análisis por microscopía de fuerza atómica. Los métodos descritos son útiles para la caracterización bioquímica, biofísica y estructural de la AICD y los efectos de las chaperonas moleculares sobre la agregación de AICD.

Protocolo

1. Expresión recombinante de dominio intracelular APP (AICD)

1. Transformar E. coli cepa BL21 con AICD humana (residuos 649-695 de APP, neuronal numeración isoforma) clonado en el vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Este vector se expresa por AICD como el resto C-terminal de una proteína de fusión de glutatión-S-transferasa (GST). Este vector también codifica una secuencia de escisión de trombina para facilitar la eliminación de la fracción GST. Los detalles de la clonación AICD en pGEX-4T-1 se encuentra en nuestra publicación anterior ^4.
2. A partir de una sola colonia, inocular 10 ml de caldo LB con ampicilina (100 mg / ml), y....

Discusión

En este protocolo hemos descrito un procedimiento para la obtención de DAI de alta pureza para análisis estructurales, biofísicos y bioquímicos. Este procedimiento no requiere un equipo sofisticado y cromatografía es por tanto accesible a la mayoría de los laboratorios. Otros grupos han purificado AICD ^5-7,16, incluyendo GST-AICD ^17-19, para los análisis bioquímicos / estructural. Las desventajas de los protocolos anteriores incluyen mala solubilidad de AICD ^16, menos de pureza ideal

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
La trombina	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760
Proteína Bradford ensayo de reactivos	Bio-Rad	500-0002
Azul de Coomassie	Bio-Rad	161-0786
IPTG (isopropil-beta-D tiogalactopiranósido)	Sigma-Aldrich	I6758
Glutatión-agarosa	Sigma-Aldrich	G4510
p-aminobenzamidina-agarosa	Sigma-Aldrich	A7155
Proteasa completo cóctel inhibidor	Roche	11836170001
Slide-A-Lyzer cassettes de diálisis	Thermo Scientific	66380
Columnas para cromatografía	Evergreen Scientific	208-3367-050
Emulsionante	Avestin, Inc	Emulsiflex-C3	Altamente recomendado
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Mica discos	Ted Pella	50-12
AFM voladizos	Bruker	MSNL-10
WSxM software	Nanotec	N / A	P.ee descarga