Núcleos están aislados cardíaca a través de la sedimentación y la densidad de immunolabeled con anticuerpos contra el material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar y clasificar los núcleos de cardiomiocitos mediante citometría de flujo.
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Artículo de método
El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem
En este artículo
Resumen
Resumen
Identificación de los núcleos de cardiomiocitos ha sido un desafío en secciones de tejido, como la mayoría de las estrategias se basan sólo en proteínas marcadoras frente al citoplasma de 1. Los eventos raros en los miocitos cardíacos, como la proliferación y la apoptosis requiere una identificación precisa de los núcleos de los miocitos cardíacos para analizar la renovación celular en la homeostasis y en condiciones patológicas 2. En este caso, se proporciona un método para aislar núcleos de cardiomiocitos de post mortem del tejido por la sedimentación y la densidad de inmunomarcación con anticuerpos contra el material pericentriolar 1 (PCM-1) y la clasificación posterior de citometría de flujo. Esta estrategia permite un análisis de alto rendimiento y el aislamiento con la ventaja de trabajar igualmente bien en tejido fresco y material de archivo congelado. Esto hace posible el estudio de material ya reunido en biobancos. Esta técnica es aplicable y probado en una amplia gama de especies y adecuado para múltiples aplicaciones posteriores tales como el carbono-14 contactos 3, célula-CYculo 4 de análisis, la visualización de los análogos de timidina (por ejemplo, BrdU y UDI) 4, el análisis de transcriptoma y epigenéticos.
Protocolo
1. El aislamiento de los Núcleos cardiaca
- Tubos Coat ultracentrífuga Beckman (Tubos de centrífuga # 363664) con 10 ml de solución de revestimiento 1% de BSA / PBS. Tape los tubos y dejar que gire durante 30 minutos en un rotor de tubo. Eliminar la solución de revestimiento y dejar que la centrífuga tubos de aire seco (un tubo por el corazón del ratón se requiere para el análisis de los corazones de ratón individuales, alternativamente hasta 5 corazones de ratón o 1 g de tejido cardíaco de una especie diferente (por ejemplo, humano) puede ser procesado en un tubo).
- Todos los pasos siguientes se debe realizar en hielo. Diseccionar el ventrículo izq....
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Discusión
La identificación precisa de los núcleos de cardiomiocitos es crucial para el análisis de los procesos regenerativos en el miocardio 2,3. Las técnicas convencionales para aislar cardiomiocitos a partir de tejido fresco se basan principalmente en la digestión enzimática de proteínas de matriz extracelular y la posterior purificación de las células intersticiales por centrifugación a baja velocidad. La purificación adicional de cardiomiocitos vivos a partir de células madre embrionarias (CES) puede ser realizad.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer Marcelo Toro para la asistencia con la citometría de flujo. Este estudio fue apoyado por el sueco de corazón y pulmón Fundación, la Comisión Europea el 7 º PM "CardioCell", Consejo Sueco de Investigación, seguros AFA y ALF. OB fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1. Tampón de lisis | |||
| Nombre del reactivo | |||
| 0,32 M de sacarosa | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM de CaCl 2 | |||
| 5 mM de acetato de magnesio | |||
| 2,0 mM de EDTA | |||
| 0,5 mM EGTA | |||
| 1 mM de DTT |
| 2. Sacarosa tampón |
|---|
| Nombre del reactivo |
| 2,1 M de sacarosa |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM de acetato de magnesio |
| 1 mM de DTT |
| 3. Los núcleos buffer de almacenamiento (NSB más) |
|---|
| Nombre del reactivo |
| 0,44 M de sacarosa |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) |
| 70 mM de KCl |
| 10 mM MgCl 2 |
| 1,5 mM de espermina |
| Reactivos y Equipos | Empresa |
|---|---|
| Isotipo IgG de conejo-chip de grado, # ab37415 | Abcam |
| De conejo anti-PCM-1 anticuerpo, # HPA023374 | Atlas anticuerpos |
| Donkey seg. anticuerpos, anti-conejo Alexa 488 Fluor, # A-21206 o equivalente seg. anticuerpos fluorescentes | Tecnologías de la Vida |
| DRAQ5 | Biostatus |
| coladores de células de 30 m, micras y 70 micras 100 | BD Biosciences |
| Vidrio douncer (40 ml) y sela mano del mortero "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
| T-25 Ultra-Turrax | IKA Alemania |
| La dispersión de herramientas S25 N-18 G | IKA Alemania |
| Beckman Avanti Centrífuga | Beckman Coulter |
| Tubos Falcon de 15 ml y 50 ml | VWR |
| Tubos de centrífuga Beckman # 363664 | Beckman Coulter |
| JS13.1 rotor de giro libre | Beckman Coulter |
| Afluencia citómetro | Beckman Coulter |
| Tubo de los rotadores | VWR |
Referencias
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O.
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Reimpresiones y permisos
