Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

Resumen

Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.

Resumen

Para entender el papel de un gen en el desarrollo de colitis, se compararon las respuestas de los ratones de tipo salvaje y el gen de interés ratones knockout deficientes a colitis. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas del huésped, sin embargo, es posible diferenciar el papel de un gen de interés en células de médula ósea derivadas de médula y no óseo células derivadas mediante la técnica de trasplante de médula ósea. Para cambiar la médula ósea procedentes de células genotipo de los ratones, la médula ósea original de los ratones receptores fueron destruidas por irradiación y luego se sustituye por la nueva médula ósea del donante de genotipo diferente. Cuando de tipo salvaje ratones donantes de médula ósea se trasplantan a ratones knockout, se podría generar ratones knockout con la expresión del gen de tipo salvaje en células de médula ósea derivadas. Por otra parte, cuando los donantes ratones knockout médula ósea trasplantadas a ratones receptores de tipo salvaje, de tipo salvaje ratones sin el gen de interés expresarde la médula ósea células derivadas fueron producidos. Sin embargo, el trasplante de médula ósea puede no ser 100% completo. Por lo tanto, hemos utilizado cúmulo de diferenciación (CD) moléculas (CD45.1 y CD45.2) como marcadores de las células del donante y del receptor para realizar un seguimiento de la proporción de células de la médula ósea de un donante derivados en los ratones receptores y el éxito de los trasplantes de médula ósea. De tipo salvaje ratones con genotipo CD45.1 ratones knockout y con CD45.2 genotipo fueron utilizados. Después de la irradiación de ratones receptores, las células donantes de médula ósea de diferentes genotipos fueron infundidas en los ratones receptores. Cuando la nueva médula ósea regenerada para hacerse cargo de su inmunidad, los ratones se expusieron por agentes químicos (sulfato de dextrano sódico, DSS al 5%) para inducir la colitis. Aquí también mostró el método para inducir la colitis en ratones y evaluar la función del gen de interés expresado a partir de células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés a partir de las células óseas derivadas juega un papel importante en el desarrollo de la enfermedad (tal como Escherichiatis), el fenotipo de los ratones receptores con trasplante de médula ósea puede ser alterado de manera significativa. Al final de los experimentos de colitis, la médula ósea derivada células en la sangre y la médula ósea se marcaron con anticuerpos contra CD45.1 y CD45.2 y su proporción cuantitativa de la existencia podría ser usado para evaluar el éxito del transplante de médula ósea por citometría de flujo. Éxito del trasplante de médula ósea debe mostrar una gran mayoría de genotipo donante (en término de marcador molécula de CD) a lo largo genotipo receptor tanto en la médula ósea y la sangre de los ratones receptores.

Protocolo

1. Antes-de-empezar Consideraciones técnicas

1. Le recomendamos que use C57/BL6 ratones de tipo salvaje y ratones knockout para el experimento porque los ratones con moléculas de CD correspondientes pueden adquirirse de los proveedores más importantes del ratón.
2. Puesto que es difícil realizar un seguimiento de los ratones de tipo salvaje y de ratones knockout derivados células del donante después del trasplante de médula ósea, es necesario utilizar CD45.1 ratones para representar ratones de tipo salvaje. (CD45.1 C57/SJL PESO ratones Jackson Laboratorios de stock # 002014).
3. La mayoría de las colonias de ratones son CD45.2. Nuestros ratones knockout pertenecen a CD45.2 genotipo (o bien una fuente CD45.2 ratones WT: Jackson Laboratories stock # 000664). La determinación de CD45.1 o CD45.2 genotipo se puede realizar mediante citometría de flujo de la médula ósea y la sangre periférica como se ha mencionado en la sección 7 de este protocolo.
4. Los ratones después de la irradiación han puesto en peligro la inmunidad. Mantener los ratones en instalación libre de patógenos.
5. Funcionamiento del irradiador requiere especial clearanc seguridade y formación. Para ahorrar tiempo en los procesos de formación y aprobación, lo mejor es colaborar con un laboratorio con personal cualificado que sea capaz de manejar el irradiador.
6. Muchas instituciones cuentan con laboratorios de citometría de flujo con técnicos experimentados. Para minimizar los problemas de funcionamiento de citometría de flujo, es mejor discutir su plan de citometría de flujo experimentar con el técnico con experiencia antes de empezar.
7. Los ratones fueron asignados de esta manera (10 ratones por grupo):

Grupo		Donante de médula ósea para el destinatario	Tratamiento
La	BM intercambio	CD45.1 WT KO CD45.2	DSS colitis
B			Agua control normal
C	BM intercambio	CD45.2 KO a CD45.1 PESO	DSS colitis
D			Agua control normal
E	Falso	CD45.1 WT para CD45.1 PESO	DSS colitis
F			Agua control normal
G	Falso	CD45.2 KO KO a CD45.2	DSS colitis
H			Agua control normal

* Una breve ilustración del protocolo experimental se muestra en la figura 1.

2. Los ratones receptores irradiación

1. Los ratones son criados y mantenidos en instalaciones libres de patógenos. Coloque los ratones en pie irradiación autoclave con filtro. Coloque un ratón en cada ranura de pastel de irradiación. Coloque el pastel en el irradiador y asegúrese de que el plato giratorio y el pastel está dando vuelta.
2. Encienda la bomba de airepara la ventilación. Cierre la puerta del irradiador y bloquearlo.
3. Irradiar a los ratones con 1.000 rad (que es equivalente a 10 Gy) alrededor de 10 min (dependiendo de la fuente de radiación y la vida media-). Desde este punto de tiempo, los ratones irradiados son inmunodeficientes y tienen inmunidad débil contra la infección. Después de la irradiación, tomar la tarta y colocar en un recipiente estéril para transportarlo al gabinete de bioseguridad en las instalaciones de los animales. Evite la exposición de los ratones con el medio ambiente externo para minimizar las posibilidades de infección.
4. En gabinete de bioseguridad, la transferencia a las jaulas de los ratones del ratón autoclave autoclave con ropa de cama (4 ratones por jaula Agregue agua estéril nueva suspensión Sulfatrim -. 3,12 ml por 100 ml de agua).
5. Envuelva la botella de agua con papel de aluminio, como los antibióticos son sensibles a la luz. Agitar para mezclar la botella de solución Sulfatrim bien antes de cargarlo a la jaula.

3. Donantes de Médula Ósea de extracción

1. Sacrificar los ratones con dióxido de carbono o isoflurmiento y luego sumergir en solución 1:200 Lysol. Rocíe los ratones con 70% de etanol para humedecer la piel y diseccionar huesos abiertos.
2. Remojar los instrumentos de disección en 70% de etanol para la esterilización.
3. Realizar la disección en un gabinete de bioseguridad. Utilizar los instrumentos de disección estéril para exponer el húmero, el fémur, la tibia y el peroné huesos, libre de fijación de los músculos y ligamentos.
4. Cortar abrir ambos extremos de los huesos para mostrar la médula ósea roja. Mantenga los huesos con fórceps. Lavar la médula ósea roja con PBS frío con jeringa de 3 ml y agujas de 25G a una placa de Petri. Enjuague de ambos extremos de los huesos para producir células de la médula ósea más.
5. Use 6 ml jeringas y agujas 18G1 / 2 a romper los tapones rojos de médula ósea por aspiración repetida y expulsión. Transferencia de médula ósea con 50 ml tubos Falcon.
6. Girar la médula ósea en 1.800 rpm durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento por agitación durante 5-10 segundos.
7. Diluir el tampón de lisis de RBC 10 veces con agua estéril. Anunciod 1X tampón de lisis RBC (5 ml por ratón donante) y agitar de nuevo durante 5 segundos y mantener exactamente 3 minutos a temperatura ambiente.
8. Después de 3 min, llenar los tubos con 20 ml de PBS frío para detener la lisis y mezclar. Verter el contenido a través de un filtro de células 40 micras directamente en un nuevo tubo Falcon de 50 ml.
9. Enjuague los tubos originales con 5 ml de PBS y transferir a filtro de células así. Completar hasta 50 ml con PBS y mezclar.

4. Contando Bone Marrow Donor células

1. Añadir 100 l de azul de tripano a un tubo Eppendorf y 100 l de suspensión de médula ósea a un tubo Eppendorf y se mezcla. Pipetear la mezcla de células teñidas con un hemocitómetro.
2. La cantidad de células se calcula por recuento total de células de médula ósea de estar en los tubos Falcon = número de células sin teñir en 16 cuadrados x 2 (debido a la dilución Trypan azul) x 10.000 x 50 ml
3. Decantar las células de médula ósea en 50 ml en tubos Falcon de 2.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
4. Eliminar el sobrenadante. Basadoen el total de células, se resuspende el pellet con PBS a 1 x 10 ⁸ células por ml

5. Infusión a ratones receptores

1. Calentar los ratones receptores sobre una almohadilla de calor y bajo una lámpara de calentamiento. Ponga los ratones receptores de inmovilización. Inyectar 1 x 10 ⁷ células por ratón en 100-200 l por vía intravenosa.
2. La inyección de médula ósea de un donante se debe hacer entre 4-24 horas después de la irradiación.
3. Manténgase 4 ratones inyectados por jaula. Mantener los ratones receptores inyectados en jaulas autoclave con agua tratada con antibióticos durante las primeras 4 semanas en las instalaciones patógeno animal libre y dejar que los ratones recuperar la inmunidad. Cambio jaulas, tratado con antibióticos en aguas y alimentos cada 4 días para mantener la higiene.

6. La inducción de la colitis y la evaluación de la colitis

1. 4 semanas después del trasplante de médula ósea y la irradiación, cambiar a agua normal sin antibióticos y mantener los ratones durante 2 semanas más para recuperar su normalidadla microflora intestinal.
2. 6 semanas después de la inyección de médula ósea, medir el peso corporal inicial. Algunos ratones se les da 5% de sulfato de dextrano en beber agua ad libitum para inducir la colitis. Algunos ratones se les da agua potable regular sólo como grupos de control normales.
3. 5 días después, extraer sangre periférica, traslado a tubos recubiertos de heparina (Vacutainer) y mantener en hielo. Piscina de la sangre de los ratones 4 a 1 metro. Combine 300 l de sangre con 300 l de buffer de tinción celular = 600 l. Divida la sangre a 5 tubos Eppendorf, cada uno con 100 l.
4. Sacrificar los ratones con dióxido de carbono o isoflurano. Evaluar resultados macroscópicos daños (por favor refiérase a otra publicación vídeo JOVE para obtener más información ^1). Medir el cambio de peso corporal. Medir la longitud del intestino grueso y con calibrador digital. Observe textura heces (dura, blanda o con sangre). Determinar sangre oculta en las heces con Hemooccult. Disecciona tejidos de colon y fijar en formol para H & E tinción.
5. Disecciona un fémur bone por ratón, se extrae médula ósea y enjuagar la médula ósea con PBS frío a través de aguja 25G y una jeringa de 1 ml. De 4 estrella médula ósea se conecta a un tubo y mantener en hielo.
6. Verter la médula ósea a una placa de Petri, la cizalladura del tapón de médula ósea con aguja 18G y 5 ml jeringa varias veces hasta que no enchufe médula ósea está presente.
7. Decantar con 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Remover el sobrenadante y resuspender con 600 l tampón de tinción celular. Divida la médula ósea se resuspendieron a 5 tubos Eppendorf, cada uno con 100 l.

7. Inspección de Calidad de Trasplante de Médula Ósea por citometría de flujo

1. Etiquete cada tubo de muestra de sangre o de médula ósea # 1-5:
2. Preparar la mezcla de anticuerpos para cada tubo respectivo en la oscuridad.

# 1 No anticuerpo
# 2 30 l control de isotipo FITC + 30 mu l PE control de isotipo + 15 mu l CD16/32 bloqueo
# 3 30 l FITC CD45.1 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo
# 4 30 l PECD45.2 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo
# 5 30 l FITC CD45.1 Ab + 30 l PE CD45.2 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo

Añadir a nada muestra de sangre o de médula ósea # 1

Añadir 5 l de mezcla de anticuerpos # 2 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 2

Añadir 3 l de mezcla de anticuerpos # 3 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 3

Añadir 3 l de mezcla de anticuerpos # 4 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 4

Añadir 5 l de mezcla de anticuerpo n º 5 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 5

3. Mantener en la oscuridad en hielo durante 30 min.
4. Añadir 2 ml de tampón de lisis 1X RBC a cada tubo. Mantener en la oscuridad en hielo durante 15 min.
5. Decantar las células a 1.500 rpm, 5 min a 4 ° C. (GH 3,8 rotor, 1.500 rpm = 350 xg) Remover el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 500 l tampón de tinción de las células en la oscuridad brevemente, a continuación, vórtice.
6. Ver el CD45.1 (representando WT) y CD45.2 (representando KO) en la sangre inmunoteñida y muestras de médula ósea por citometría de flujo. Seleccione FITC para representar PESO CD45.1 y PE para representar KO CD45.2.
7. Analizar los resultados de la citometría de flujo por software FlowJo. Calcular la relación de FITC: PE o PE relación: relación de FITC para determinar si el genotipo donante es el genotipo predominante en la sangre y la médula ósea.

Resultados

Si el gen de interés desempeña un papel significativo en las células inmunes durante el desarrollo de la colitis, los ratones que recibieron médula ósea de genotipo diferente a través de trasplante de médula ósea (WT a KO o KO a WT) debería tener una respuesta alterada a la colitis DSS. Uno de los parámetros más importantes para la determinación de la gravedad de la colitis es la tinción H & E de los tejidos de colon. Colon cambios en la estructura de tejido y los signos de la inflamación pueden evaluar cuantitativa...

Discusión

Este enfoque trasplante de médula ósea es adecuado para la investigación de la inmunología colitis, infección, cáncer, obesidad y otras enfermedades. Este experimento de trasplante de médula ósea es necesaria cuando el gen de interés se expresa en tanto derivadas de médula ósea y no células de la médula ósea derivados y el gen de interés se sospecha para mediar la enfermedad por células de cualquiera de la población. Por ejemplo, péptido antimicrobiano de catelicidina está demostrado que modulan la colitis aguda. Pero s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Célula tampón de tinción	BioLegend	# 420201
10X tampón de lisis RBC	BioLegend	# 420301
FITC ratón isotipo de control	BioLegend	# 400207
PE ratón isotipo de control	BioLegend	# 400211
PE anti-ratón CD45.2	BioLegend	# 109807
FITC anti-ratón de CD45.1	BioLegend	# 110705
Anti-ratón CD16/32 bloqueo	BioLegend	# 101301
40 filtro de células micras	Fisherbrand	# 22363547
PBS 1X	MP Biomedicals	# 1860454
La heparina	Fisherbrand	# BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (pescador)
Lysol IC	Andwin Científico	NC9745686 (pescador)
Vaccutainer	BD	# 8000813
Ratón restrainer	Braintree Scientific	# TV-150
Irradiador	JL Pastor y Asociados	Mark I 68A
Citómetro de flujo	BD	BD FACSCanto II
Citómetro de flujo de tubo de ensayo	Halcón	# 352052
Calibre digital	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult TIC	Beckman Coulter	G0328QW