Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

Resumen

Hemos desarrollado una plataforma de software que utiliza Imaris Neuroscience, ImarisXT y MATLAB para medir los cambios en la morfología de una forma indefinida tomado de tres dimensiones de fluorescencia confocal de células individuales. Este nuevo enfoque se puede utilizar para cuantificar los cambios en la forma celular después de la activación del receptor y por lo tanto representa una posible herramienta adicional para el descubrimiento de fármacos.

Resumen

Las herramientas de software más comunes de análisis disponibles para la medición de imágenes de fluorescencia son para datos de dos dimensiones (2D) que dependen de los ajustes manuales para la inclusión y la exclusión de los puntos de datos, y asistido por ordenador de reconocimiento de patrones para facilitar la interpretación y el análisis de resultados. Se ha convertido cada vez más importante para ser capaz de medir las imágenes de fluorescencia construidas a partir de conjuntos de datos tridimensionales (3D) con el fin de ser capaz de capturar la complejidad de la dinámica celular y entender la base de la plasticidad celular dentro de los sistemas biológicos. Instrumentos sofisticados microscopía han permitido la visualización de 3D imágenes de fluorescencia a través de la adquisición de imágenes multiespectrales de fluorescencia y un software de análisis de gran alcance que reconstruye las imágenes de confocal pilas que luego proporcionan una representación 3D de las imágenes recogidas en 2D. Diseño avanzado de los métodos basados ​​en estereología han pasado de la aproximación y los supuestos de la originaciónl modelo basado estereología ¹ incluso en secciones de tejidos complejos ^2. A pesar de estos avances científicos en microscopía, permanece una necesidad de un método analítico automatizado que explota completamente los datos 3D intrínsecas para permitir el análisis y la cuantificación de los complejos cambios en la morfología celular, la localización de proteínas y tráfico de receptores.

Las técnicas actuales disponibles para cuantificar las imágenes de fluorescencia incluyen Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y la imagen J (NIH), que proporcionan un análisis manual. Imaris (Andor Technology, Belfast, Irlanda del Norte) software proporciona la función de MeasurementPro, que permite la creación manual de los puntos de medición que se pueden colocar en una imagen de volumen o dibujado en una serie de cortes 2D para crear un objeto 3D. Este método es útil para mediciones de punto de un solo clic para medir una distancia en línea entre dos objetos o para crear un polígono que encierra una región de interés, pero es difícil de aplicar a complex estructuras de redes celulares. Filamentos trazador (Andor) permite la detección automática de la 3D neuronal filamento-como sin embargo, este módulo ha sido desarrollado para medir estructuras definidas, tales como neuronas, que se componen de dendritas, axones y espinas (estructura de árbol). Este módulo ha sido ingeniosamente utilizado para realizar mediciones morfológicas a las células no neuronales ^3, sin embargo, los datos de salida de proporcionar información de una red celular extendida mediante el uso de un software que depende de una forma de la célula definido en lugar de ser un modelo celular amorfo en forma. Para superar el problema de analizar amorfo en forma de células y hacer el software más adecuado para una aplicación biológica, Imaris desarrollado célula Imaris. Este fue un proyecto científico con la Eidgenössische Technische Hochschule, que ha sido desarrollado para calcular la relación entre las células y orgánulos. Mientras que el software permite la detección de las limitaciones biológicas, forzando un núcleo por célulay el uso de las membranas celulares de las células del segmento, no se puede utilizar para analizar los datos de fluorescencia que no son continuas, porque se construye idealmente superficie celular sin espacios vacíos. Para nuestro conocimiento, en la actualidad no modificable por el usuario enfoque automatizado que proporciona información morfométrica de las imágenes de fluorescencia 3D ha sido desarrollado que logra información celular espacial de una forma indefinida (Figura 1).

Hemos desarrollado una plataforma analítica usando el módulo principal de software Imaris y XT Imaris interfaz con MATLAB (Mat Works, Inc.). Estas herramientas permiten la medición 3D de las células sin una forma predefinida y con inconsistentes componentes de la red de fluorescencia. Además, este método permitirá a los investigadores que han extendido experiencia en sistemas biológicos, pero no familiaridad con las aplicaciones informáticas, para llevar a cabo la cuantificación de los cambios morfológicos en la dinámica celular.

Protocolo

1. Three-dimensional Análisis morfométrico de una sola célula cambios fenotípicos

1. Embrionarias humanas de riñón (HEK293) células fueron transfectadas con hemaglutinina (HA)-etiquetados factor liberador de corticotropina receptor-2 (CRF-R2), una proteína G-receptor acoplado (GPCR) como se ha descrito previamente ^{4, 5.}
2. Las células se dejaron sin tratar (sin tratamiento, NT), estimuladas con el ligando endógeno CRF-R2, factor de liberación de corticotropina, CRF (1 mM, 30 min), o pretratadas con un selectivo antagonista de CRF-R2, anti-sauvagina 30 (como se -30, 1 mM, 30 min) antes del tratamiento con agonista.
3. Las células se fi....

Discusión

Hemos demostrado que el tratamiento CRF induce un cambio significativo en la morfología y ubicación de CRF-R2. El cambio en el CRF-R2 fue inhibido por el tratamiento antagonista selectivo. Hemos demostrado que las modificaciones no se detectaron receptores y no puede ser medido utilizando el estándar de las técnicas multiespectrales 2D. La capacidad para estudiar complejos imágenes en 3D es crítica para incorporar la complejidad de los parámetros biológicos para el análisis morfométrico. Hemos sido capaces de hacer medi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
De riñón embrionario humano (HEK293)	American Type Culture Collection	CRL-1573
Dulbecco Eagle modificado (DMEM)	Invitrogen	11965118
Suero bovino fetal (FBS)	Invitrogen	SH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b)	Invitrogen	A-11001
monoclonal anti-HA.11 (IgG 1)	Covance	16B12
DAPI	Vector Laboratories	H-1200	;
CRF	Sigma	C2917
Antisauvagine-30 (TAL-30)	Sigma	A4727