Imagen no invasiva de rechazo agudo del aloinjerto después Rat Trasplante Renal Uso<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Alexander Grabner; Dominik Kentrup; Uta Schnöckel; Gert Gabriëls; Rita Schröter; Hermann Pavenstädt; Otmar Schober; Eberhard Schlatter; Michael Schäfers; Stefan Reuter

doi:10.3791/4240

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Artículo de método

Imagen no invasiva de rechazo agudo del aloinjerto después Rat Trasplante Renal Uso

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DOI:

10.3791/4240

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28 de abril de 2013

Alexander Grabner^*¹ , Dominik Kentrup^*¹ , Uta Schnöckel² , Gert Gabriëls¹ , Rita Schröter¹ , Hermann Pavenstädt¹ , Otmar Schober² , Eberhard Schlatter¹ , Michael Schäfers^*³ , Stefan Reuter^*¹

¹Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, ²Department of Nuclear Medicine, University of Münster, ³European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Nos en este documento presentamos un modelo de trasplante renal de rata para evaluar de forma no invasiva el rechazo agudo del aloinjerto mediante tomografía por emisión de positrones con 18F-fluorodesoxiglucosa.

Resumen

El número de pacientes con enfermedad renal en etapa terminal, y el número de receptores de aloinjertos renales aumenta continuamente. Los episodios de rechazo del injerto celular agudo (AR) son un factor pronóstico negativo para la supervivencia del injerto a largo plazo, y su diagnóstico oportuno es crucial para la función del injerto ^1. En la actualidad, AR puede sólo puede ser diagnosticado por biopsia central con aguja, la cual, como un método invasivo, descubre riesgo significativo de lesión del injerto o incluso la pérdida. Por otra parte, las biopsias no son factibles en los pacientes que toman medicamentos anticoagulantes y el sitio de muestreo limitado de esta técnica puede dar lugar a resultados falsos negativos si el AR es focal o en parches. Como consecuencia, esto dio lugar a una búsqueda constante de nuevos métodos de detección de AR, que a menudo tiene que hacerse en animales, incluyendo el uso de varios modelos de trasplante.

Desde principios de los 60 la rata trasplante renal es un método experimental bien establecido para el exación y el análisis de AR ^2. Estamos aquí presentes además pequeña tomografía por emisión de positrones animales (PET) con ¹⁸ F-FDG (FDG) para evaluar la AR en una rata renal modelo uninefrectomizadas trasplantes alogénicos, y proponer injerto imágenes FDG-PET como una nueva opción para un no-invasivo, específico y el diagnóstico precoz de la AR también para la situación humana ^3. Además, este método puede ser aplicado para el seguimiento para mejorar el seguimiento de rechazo del trasplante ^4.

Protocolo

1. La recuperación del donante de órganos

Configure el microscopio estereotáctica, peso récord de la vieja rata de 8-10 semanas (donante y el peso corporal del receptor debe coincidir).
Anestesiar la rata donante (Lewis Brown Noruega F1, F1 LBN) el uso de oxígeno / inhalación de isoflurano (isoflurano 4% / 2 L / min de oxígeno). Mantener la anestesia mediante la reducción de isoflurano al 2-2,5%.
Coloque la rata anestesiada en la plataforma de la cirugía. Fijar extremidades de la rata con cinta adhesiva sobre la almohadilla y aplicar pomada oftálmica (Bepanthen, Bayer) a los ojos de la rata.
Shave y desinfectar el abdomen de la rata y realizar una incisión de línea media ventral desde el pubis hasta el borde caudal del hígado. Exponer el riñón izquierdo y sus vasos moviendo cuidadosamente el intestino hacia el lado derecho. Colocar una hoja delgada de gasa sobre el riñón izquierdo y humedecerlo con solución salina isotónica calentada para evitar la desecación.
Diseccionar cuidadosamente el tejido graso con Dumont Pinzas punta en ángulo (SS-Dumont45 Pinzas Inox Médico, Herramientas de Bellas Ciencia, n º de cat 11203-25) que envuelve el uréter izquierdo. Evite el contacto directo con el uréter, en cambio, movilizar con suficiente tejido graso circundante.
Separe la vena renal izquierda de la arteria renal con pinzas Dumont punta en ángulo. Quite toda grasa y tejido conectivo de los dos vasos y cauterizar los vasos adrenales y testiculares.
Diseccionar la aorta y la vena cava inferior (VCI) por encima y por debajo de su unión con la arteria renal izquierda y la vena, respectivamente, y todas las arterias cauterizar salientes.
Sujete la aorta suprarrenal con una pinza de microcirugía (Micro Serrefines, Herramientas de Bellas Ciencia, n º de cat 18055-04) por encima de la arteria renal izquierda, lo más cerca posible a la arteria mesentérica superior. Ligar la aorta infrarrenal con seda quirúrgica (5-0, Vömel, ref. 14739) aproximadamente 5 mm por debajo de la arteria renal izquierda.
Ligar la VCI infrarrenal con seda quirúrgica (5-0, Vömel) y sujetar el IVC suprarrenalcon una pinza de microcirugía (Serrefines Micro, Herramientas de Bellas Ciencia, art 18055-03).
Cortar la vena renal lo más cerca posible de la IVC con tijeras finas (Iris Scissors - ToughCut rectas 11,5 cm, Herramientas de Bellas Ciencia, art 14058-11).
Poco a poco la perfusión del riñón in situ con 2 solución de perfusión HTK ml de helado (CUSTODIOL HTK, Dr. Franz Köhler Chemie) mediante la inserción de una cánula (Microlance 3 27G ¾, BD, cat.no. 302200) en la aorta infrarrenal. Confirme que los cambios de color renales (ahora oliva teñido).
En primer lugar, seccionar la aorta suprarrenal, a continuación, la aorta infrarrenal y, finalmente, el uréter lo más cerca posible a la vejiga urinaria.
Retire el riñón y en la irrigación vascular junto con el uréter y la tienda en solución de perfusión HTK en hielo.
La eutanasia a la rata donante mediante la eliminación de las pinzas vasculares y la escisión consecutiva del corazón bajo anestesia.

2. Receptor Preparación y Transplantación

Configure el microscopio estereotáctica, peso record de la rata.
Anestesiar la rata receptora (Lewis) con isoflurano 4%. Mantener la anestesia mediante la reducción de isoflurano al 2-2,5%.
Coloque la rata anestesiada en la plataforma de la cirugía. Fijar las extremidades de la rata con cinta adhesiva sobre la almohadilla y aplicar el ungüento oftálmico de los ojos de la rata `s. Monitor y control de la temperatura corporal central usando un sensor de temperatura rectal y una almohadilla de calentamiento. Durante la cirugía repetitivamente controlar la temperatura, la respiración y la frecuencia cardiaca del animal.
Shave y desinfectar el abdomen y realizar una incisión de línea media ventral desde el pubis hasta el borde caudal del hígado. Utilice un forcutting escalpelo de la piel con el fin de minimizar el trauma de la piel. Exponer el riñón izquierdo y sus vasos moviendo el intestino hacia el lado derecho.
Retire con cuidado la cápsula renal con pinzas Dumont punta en ángulo y los hisopos de algodón.
Ocluir la arteria renal izquierda, vena y uréter cerca de la renalhilo con dos ligaduras con hilo quirúrgico (Mersilene 4-0, Ethicon, cat. no. EH6732H). Impuestos Especiales de la mayor parte del riñón, dejando sólo el hilio renal. Limpie la superficie de corte con hisopos de algodón y compruebe si el sangrado. Añadir otra ligadura si es necesario.
Diseccionar cuidadosamente sin rodeos a través del tejido conectivo que cubre la aorta infrarrenal y la vena cava caudal en el sitio con hisopos de algodón.
Separe cualquier nervio visible desde la aorta infrarrenal y la vena cava utilizando pinzas Dumont punta en ángulo.
Diseccionar cuidadosamente a través de la hoja de tejido conectivo entre la aorta infrarrenal y la vena cava, formando dos aberturas de 2-4 mm de longitud: El primero por debajo de la ramificación de los vasos testiculares, y el segundo por encima de la bifurcación de los vasos ilíacos comunes. Cauterize iliolumbar las arterias y las venas en el medio.
Dibuje un solo hilo quirúrgico (Mersilene 0;. Ethicon, gato no.EH6665E) a través de cada una de las dos aberturas. El uso de estos hilos tiran de la infrarrenalaorta y la vena cava suavemente hacia el lado derecho del animal para obtener acceso a los vasos de ramificación en el sitio dorsal. Cauterize cualquiera de estos vasos entre las dos aberturas y quitar los hilos quirúrgicos a partir de entonces.
A continuación, ocluir la aorta y la vena cava inferior mediante la aplicación de las agujas del reloj cuatro pinzas de microcirugía (Micro Serrefines, Fine Science Tools, n º de cat 18055-04) que comienzan en la apertura superior con la aorta y terminando con la vena cava en la abertura superior (micro Serrefines , Science Tools Bellas, art 18055-03).
Después cuidadosamente perforar el final superior de la parte aislada de la aorta con una aguja (27G Microlance 3 ¾, BD, cat.no. 302200), inserte la hoja inferior de un resorte de tijera fina (Vannas Tijeras primavera - 3 mm Hojas, Fine Ciencia Herramientas, cat.no 15000-00) a través de la abertura de punción y realizar una incisión longitudinal corto. Enjuague la aorta aislada con solución de perfusión HTK-helada para eliminar la sangre restante.
Del mismo modo, cuidadosamente perforarel final inferior de la parte aislada de la vena cava con una aguja, insertar la cuchilla inferior de un resorte de tijera fina a través de la abertura de punción y realizar una incisión longitudinal que termina poco por debajo de la incisión de la aorta. Otra vez, enjuague el recipiente para eliminar cualquier resto de sangre.
Retire el injerto renal de la solución de almacenamiento. Colóquelo debajo de la posición anterior del riñón izquierdo, y asegúrese de que está correctamente orientado.
Compruebe la orientación de la arteria renal de los injertos y asegurarse de que no haya torceduras. A continuación, colocar una hoja delgada de gasa sobre el injerto y humedecerlo con solución de perfusión HTK enfriado con hielo para que se enfríe, y para evitar la desecación.
Fijar la abertura de la parte de la pieza suprarrenal de la aorta en la que la arteria renal del injerto se abre en con hilo quirúrgico (9-0 Ethilon, Ethicon, n º de cat 2809G..) - Primero en la parte superior, a continuación, en el extremo inferior de la incisión de la aorta. Cierre la incisión hacia la derecha con una sutura continua con hilo quirúrgicoEthilon (9-0), Dumont forceps punta en ángulo y un porta-agujas Castroviejo curva (Herramientas de Bellas Ciencia, cat.. No 12061-01). Luego, cubra la primera sutura de tejido conectivo a través de una segunda sutura continua hacia la izquierda. Ahora, sólo la parte inferior de la pieza aórtica del injerto sigue siendo a ser cerrado. Regularmente enfriar la solución de perfusión del injerto con HTK enfriado con hielo.
Perfundir el injerto con 1 ml de solución de perfusión HTK enfriado en hielo a través de una aguja de punta roma se inserta en el extremo abierto de la pieza aórtica injertos de validación de la estanqueidad y la integridad de la sutura, así como la eliminación de la sangre restante en el injerto. Después, ligar el extremo abierto de la pieza aórtica con seda quirúrgica (5-0, Vömel).
Compruebe la orientación de la vena renal injertos y asegurarse de que no haya torceduras.
Fijar la abertura de la vena del injerto con hilo quirúrgico (Ethilon 9-0) - primero en la parte superior, a continuación, en el extremo inferior de la incisión en la vena cava. Cierre de la incisiónhacia la derecha con una sutura continua con hilo quirúrgico (Ethilon 9-0), Dumont pinzas punta en ángulo y un porta-agujas Castroviejo curvo. Regularmente enfriar la solución de perfusión del injerto con HTK enfriado con hielo.
Antihorario eliminar las abrazaderas de microcirugía, comenzando con la vena cava superior abrazadera. Después de quitar el último pinzamiento aórtico, deje cuidadosamente sangrado leve finalmente con hisopos de algodón. Después de unos segundos, el injerto se volverá rosa teñida, y debe aparecer contracciones uretric.
Para la inserción del uréter en la vejiga injertos `s destinatario retire con cuidado una pequeña porción de la musculatura en la parte superior de la vejiga usando una tijera primavera Vannas (Estudiante Vannas tijera primavera rectas, Herramientas de Bellas Ciencia, n º de cat 91500-09 ). A continuación, retire el tejido circundante (principalmente grasa) del uréter de injerto utilizando pinzas Dumont punta en ángulo. Por lo tanto, tomar cuidadosamente la punta del uréter y suavemente separar el tejido circundante de grasa, conectivo y de los vasos incrustados lado a otrom que tirando de ellas en la dirección opuesta. Fijar la punta uretric en el extremo de un hilo quirúrgico (6-0 Prolene, Ethicon, gato.. Ninguna 8697H) y perforar la parte superior previamente preparada de la vejiga con la aguja fija. Tire el uréter a través de la vejiga y salir de ella en la base a través de una segunda perforación.
Fijar el previamente del uréter separados tejido en la parte superior de la vejiga con hilo quirúrgico (Ethilon 9-0). Corte la punta del uréter con el hilo quirúrgico adjunto y tire el uréter hacia la vejiga, presionando suavemente desde abajo. A continuación, cierre la segunda punción vesical con hilo quirúrgico (Ethilon 9-0).
Cierre de la pared abdominal y la piel por dos suturas continuas pero separado utilizando hilo de sutura quirúrgica (Mersilene 0). Desinfectar la herida con yodo Pividon y administrar buprenorfina (0,1 mg por kg / peso corporal / día) sc durante tres días después de la cirugía para controlar el dolor de la herida.

3. Imágenes aloinjerto Rechazo

Anestesiar la rata postprandiales utilizando isoflurano 2-2,5%.
30 MBq de FDG (30 MBq de FDG en 0,1 ml de NaCl al 0,9%) se administró iv a través de la cateterización de una vena lateral de la cola con un G catéter 24 (Braun, Introcan, 4252500-01). Después, purgar el catéter con 0,9 ml de solución de NaCl al 0,9%.
Agregar la rata en una inmovilización sin anestesia hasta el inicio de la exploración y el hidrato de animales por inyección iv de 1 ml de solución de NaCl al 0,9% por hora.
Rata reanestesiar utilizando isoflurano 2% inmediatamente antes de que comience la exploración.
Coloque rata anestesiada en una alta resolución de la cámara basada en múltiples hilos animales cámara quadHIDAC PET (Positron Systems Ltd Oxford, Oxford, Reino Unido). La resolución espacial del escáner de PET es de 1,0 mm y es constante en todo el campo de visión (diámetro, 165 mm de longitud axial, 280 mm). Supervisión y control de la temperatura corporal durante el análisis utilizando un sensor de temperatura rectal y la anestesia de control con un oxímetro de pulso.
Inicio adquisición dinámico para 60 men el inicio de 180 minutos después de la FDG-inyección para reducir la acumulación de trazador en los riñones causado por la excreción renal de FDG.
Aplicar 5 MBq de ¹⁸ iv F-fluoruro y realizar otra exploración PET inmediatamente después de la inyección de ¹⁸ F-fluoruro durante 60 min sin mover la posición de la rata en el escáner para la identificación de parénquima renal y para el cálculo de ^{18 F-5} aclaramiento. Reconstruir imágenes de ambas exploraciones. Trazar manualmente un volumen de interés (VOI) en las imágenes reconstruidas 2 minutos después de la inyección ^{de 18} F-fluoruro (perfusión de fase) en torno a la corteza renal y transferir el VOI a las imágenes FDG. Excluir cuidadosamente la pelvis renal del VOI. Reconstruir imágenes de ambos análisis y trazar manualmente un volumen de interés (VOI) alrededor de la corteza renal. De datos en modo de lista fueron reconstruidas en imágenes con un tamaño de voxel de 0,4 × 0,4 × 0,4 mm ^3. Excluir cuidadosamente la pelvis renal del VOI.
Calcular la captación de FDG por la relación Of recuentos totales y volumen y calcular el porcentaje de dosis inyectada (% ID). Se utilizó MATLAB (versión R2011b, MathWorks, Natick, MA, EE.UU.) y la obtención de imágenes tomográficas (TIM) Versión 2.8 para el análisis de imágenes.