Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

Resumen

El mesénquima craneal experimenta movimientos dramáticos morfogénicas probable que proporciona una fuerza motriz para la elevación de los pliegues neurales ^1,2. Aquí se describe un sencillo Ex vivo Explantar ensayo para caracterizar los comportamientos celulares de la mesenchyme craneal durante neurulación. Este ensayo tiene numerosas aplicaciones, incluyendo ser susceptible de manipulaciones farmacológicas y análisis de imágenes en directo.

Resumen

El sistema nervioso central se deriva de la placa neural que sufre una serie de movimientos morfogenéticos complejos resultantes en la formación del tubo neural en un proceso conocido como neurulación. Durante tubo neural, la morfogénesis del mesénquima que subyace en la placa neural se cree para conducir elevación pliegue neural. El mesénquima craneal está compuesto por el mesodermo paraxial y las células de la cresta neural. Las células del mesénquima craneal forma una malla pourous compuesto de células con forma de estrelladas y mezcla de la matriz extracelular (ECM) hebras que soportan los pliegues neurales. Durante la neurulación, el mesénquima craneal experimenta reordenamientos estereotipadas resultantes en su expansión y estos movimientos se cree que proporcionan una fuerza impulsora para la elevación pliegue neural. Sin embargo, las vías y los comportamientos celulares que conducen a la morfogénesis mesénquima craneal siguen siendo poco estudiada. Las interacciones entre el ECM y las células de los craneales thes subyacen mesénquimacomportamientos e celulares. Aquí se describe un ensayo ex vivo sencillo explante ideado para caracterizar el comportamiento de estas células. Este ensayo es modificable a manipulaciones farmacológicas para diseccionar la vías de señalización implicadas en vivo y análisis de imágenes para caracterizar mejor el comportamiento de estas células. Se presenta un experimento representativo que demuestra la utilidad de este ensayo en la caracterización de las propiedades migratorias de la mesenchyme craneal en una variedad de componentes de ECM.

Introducción

Cierre del tubo neural en la región craneal se produce entre 8,5 días de embriones (E8.5) y 9,5 en el embrión de ratón. Si no se cierra correctamente el tubo neural en los resultados de la cabeza en la anencefalia, un defecto de nacimiento común estructural en los seres humanos y es incompatible con la vida. Las fuerzas que impulsan cierre del tubo neural cefálica se generan a partir tanto del tejido neural en sí y la epidermis que rodea y mesénquima ^3. En particular, la expansión del mesénquima craneal se piensa que es esencial para la elevación del ^1,2 craneal pliegues neurales. El mesénquima craneal es rica en proteínas de ECM en particular, proteínas glicosiladas, tales como proteoglicanos de sulfato de heparina, sulfatos de condroitina y ^4-8 hialuronato.

A diferencia en el embrión de pollo en donde las células de la cresta neural emigran desde el tubo neural dorsal tras el cierre del tubo neural, de la cresta neural en el embrión de ratón migra al mismo tiempo que los pliegues neurales comienzan a rISE (después de la etapa de somite 5). Así, durante la neurulación en el embrión de ratón, el mesénquima craneal está compuesto de células derivadas de la cresta neural y el mesodermo paraxial. La cresta neural y el mesodermo paraxial poblaciones son inducidos en diferentes momentos en el desarrollo; localizados en posiciones diferentes en el embrión y se desarrollan en diferentes estructuras de ^9,10. El mesodermo paraxial se origina a partir de la línea primitiva y migra a la región anterior del embrión que la base de la placa neural presuntiva. La cresta neural es inducida en la unión de la placa neural y ectodermo epidérmico, sufre un epitelial a mesénquima y deslamina justo antes de la elevación del pliegue neural en el embrión de roedor. Las células de la cresta neural migran a lo largo de los caminos estereotipados en el mesodermo paraxial subectodermal al arco branquial, frontonasal y el mesénquima periocular. El mesodermo paraxial contribuirá a algunos de los huesos de la bóveda del cráneo y los músculos de la cara, mientras que the cresta neural contribuirá a otros huesos del cráneo y de la cara, además de los nervios craneales ^9-11. El mesodermo paraxial y linajes de la cresta neural puede ser diferente marcado por la Mesp1-cre y cre-Wnt1 líneas de ratones transgénicos, respectivamente ^9.

El papel esencial del mesénquima craneal en el cierre del tubo neural se ha deducido a partir de experimentos en los que el tratamiento de los embriones de roedores con ECM interrumpir agentes tales como hialuronidasa, condroitinasa ABC, heparitinasa o Diazo-oxo norleucina-(DON) durante neurulación afectada cierre del tubo neural ^{7, 12-14.} En estos experimentos, el análisis histológico de secciones estáticas siguientes neurulación reveló dysmorphogeneis asociados de la craneal mesénquima ^7,12-14. Sin embargo, puesto que el agente teratógeno tenían acceso a múltiples tejidos, lo que queda por determinar si el mesénquima craneal es realmente el tejido diana. En apoyo a la conclusión de que este tejidoes esencial para el tubo neural, el mesénquima craneal parece anormal en los análisis histológicos en algunos mutantes de ratón con exencefalia ^15-17. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el efecto de la mutación sobre el comportamiento celular de la mesénquima craneal no se ha abordado.

Hemos ideado un ensayo in vivo explante ex para examinar directamente la consecuencia de la mutación genética o manipulación farmacológica sobre el comportamiento de células mesenquimales craneal ^15. Este ensayo es similar a la publicada por Tzahor et al 2003 para acceder al potencial de diferenciación del mesénquima craneal que subyace a los ¹⁸ rhombomeres excepto hemos modificado la disección explante para estudiar las propiedades migratorias de las poblaciones más anteriores del mesénquima craneal que subyacen a la anterior neural plato. Nuestro método es también una modificación de las pruebas de explantes a cabo en el embrión de pollo para analizar el comportamiento migratorio de la cresta neural con keY las diferencias. Preparativos previos han extirpado la cresta neural o el mesodermo paraxial más posterior ^19,20. Además, durante la elevación neural veces en el embrión de pollo, la cresta neural aún no ha emigrado desde el tubo neural dorsal y por lo tanto explantes tomados de la mesodermo paraxial anterior no contienen células de la cresta neural. En nuestro ensayo, los explantes craneales mesénquima que consisten de mesodermo paraxial, la cresta neural y ectodermo superficial se preparan y se sembraron sobre un sustrato. La manipulación experimental incluyendo el aislamiento de explantes procedentes de mutantes genéticos, enchapado explantes sobre ECM diferente o tratamientos farmacológicos se puede realizar. Las células migran desde el explante y la distancia, el número y el comportamiento puede ser analizado y comparado entre los grupos de tratamiento. Además, esta preparación es modificable para análisis de la migración celular mediante técnicas de imagen en vivo. Después del experimento de migración, los explantes pueden ser fijadas y sometidas a análisis inmunohistoquímico para pielesther dilucidar el efecto de los tratamientos. En general, el protocolo presentado aquí es un ensayo ex vivo sencillo para investigar el comportamiento del mesénquima craneal. Como un experimento representativo, utilizamos este ensayo para examinar la migración de mesénquima craneal en diferentes sustratos extracelulares.

Protocolo

1. Preparación de platos ECM Cultura recubiertos o Cubreobjetos

1. Preparar la solución ECM de stock de disolución de sustrato ECM en PBS (Dulbecco-buffer fosfato salino, Invitrogen, # 14040-133). Filtrar con un filtro de jeringa de 0,2 mm (VWR, # 28145-495) y congelar en alícuotas a -80 ° C.
2. Diluir solución ECM en PBS a la concentración deseada. Para MaxGel, diluir en DMEM (Dulbecco modificada de Eagle medio, Invitrogen, # 11995-065).
3. Si inmunofluorescencia se realizará, esterilizar 12 mm cubreobjetos circulares de vidrio (VWR, # 89015-724) mediante inmersión en etanol y dejar secar al aire. Esto debe hacerse en la campana laminar estéril. Si inmunofluorescencia no se llevará a cabo el paso 1.5.
4. Lugar esterilizado cubreobjetos en cada pocillo de una placa de pocillos 24 (Corning, n º 3526).
5. Añadir 0,5 ml de solución de substrato diluido a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se incuba a temperatura ambiente durante 3 h.
6. Aspirar la solución de ECM y lavar three veces en PBS.
7. Aspirar fuera de PBS y utilizar inmediatamente o envueltos en parafilm y se almacenaron a 4 ° C durante hasta 2 semanas.

2. Preparación de herramientas de disección

Placas de Sylgard con carbón vegetal añadido se preparan según el protocolo del fabricante. El fondo negro resistente de estas placas proporciona soporte para la fijación abajo el embrión y el color ofrece un buen contraste que facilita la visualización del embrión translúcido.

1. Para preparar las placas pesan directamente en un vaso de precipitados de tri-vierta en una balanza de 150 g de pieza en forma líquida 15 g Parte B y 1 g de polvo de carbón vegetal (World Precision Instruments, # SYLG184). Mezclar con un palito de madera o un depresor de lengua. Verter en vaso de plástico o placas de 100 cm. Utilice un soplete de butano pequeño lugar de 10 a 12 pulgadas por encima de los platos para quemar eventuales burbujas. Coloque las tapas en las placas y dejar reposar durante al menos 24 horas para ajustar.
2. Para preparar las herramientas de disección inserte un alfiler Minutien (0,1 mm diameter) en un soporte de pasador (Fine herramientas científicas, # 26002-10 y # 26018-17, respectivamente) como alternativa agujas de calibre 26 (BD, # 309597) dobladas en ángulo recto con la ayuda de fórceps puede utilizarse como instrumentos de disección. Afilado estudiantes Dumont # 5 Pinzas (Herramientas Artes Ciencia, # 91150-20) con una piedra de afilar (Fine Herramientas Científicas, # 29008-22).
3. Esterilizar todas las herramientas de disección con 70% de etanol antes de su uso.

3. Colección de Embriones

1. Sacrificar al ratón cronometrado embarazada en 8,5 días post coito acuerdo con la normativa de animales Comité de Uso y extraer el útero.
2. Place útero en una placa Petri de plástico con PBS estéril.
3. Lavar útero una vez con PBS estéril.
4. Bajo un microscopio de disección cuidadosamente quitar embrión de deciduas utilizando un par de pinzas.
5. Retire las membranas extraembryonic y ahorrar para el genotipado de ser necesario.
6. Etapa embrión contando somites. Las etapas ideales para hacer explantes para analizar celular behAvior durante la elevación del pliegue neural estaría entre los 6 y 10 somite etapas cuando los pliegues neurales están comenzando a elevar y antes de la morfogénesis importante del mesénquima craneal lleva a cabo.
7. Lavar embrión en PBS. Colocar en un plato negro sylgard con DMEM que no contiene rojo fenol (Invitrogen, # 21,063-029). Retire las membranas extraembryonic y ahorrar para el genotipado de ser necesario.

4. Preparación de explantes

1. Reorientar el microscopio en la magnificación más alta posible sobre la región de la cabeza del embrión.
2. Haga cortes con una aguja de disección en cada mano. Use una aguja para mantener el tejido en su lugar y el otro para hacer los cortes.
3. Cortar la cabeza del embrión anterior a los rhombomeres.
4. Corte a lo largo de la línea media para dividir en dos la cabeza en dos mitades iguales.
5. Corte alrededor de la periferia de la cabeza y la línea media. Estos recortes se eliminará la cresta premigratorias y ectodermo superficial en el borde exterior yla placa prechordal en la línea media. El tejido restante será el explante y contendrá la migración de la cresta neural craneal, mesodermo paraxial y ectodermo superficial.
6. A medida que el tejido se corta, eliminar los restos disecados de la cápsula, utilizando una pipeta Pasteur estéril. Esto evita confundir el explante con los restos disecados.
7. Lave suavemente el explante pipeteando arriba y abajo con una punta de pipeta y 20 l Pipetman. Esto eliminará las células débilmente conectados y evitar los bordes dentados en los explantes.
8. Recoja cuidadosamente cada explante en aproximadamente 10 l de líquido utilizando una punta de pipeta y 20 l Pipetman y el lugar en el centro de la cultura pozo cubierto.
9. Añadir 20 l de medio de cultivo suplementado con FBS al 15% para cubrir el explante.
10. Colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado (5% de CO _2, 37 ° C) durante 1-2 horas para permitir que el explante para insertarse en el fondo del plato. Ver periódicamente para asegurar que el explante no se sequefuera.
11. Cuando el explante se ha unido, añadir con cuidado a cada pocillo 250 l de DMEM suplementado con FBS al 10% que ha sido calentado a 37 ° C en un baño de agua. Una vez que haya adjuntado explantes que no se muevan cuando la placa se agita suavemente bajo el microscopio.
12. Volver plato de cultivo de tejidos incubadora.
13. Después de 24 horas, los explantes se estarán sólidamente sujetos y las células comienzan a emigrar. En este momento los agentes farmacológicos se pueden añadir a los medios de comunicación.
14. 48 h después de la siembra, las células han emigrado de los explantes. La distancia migrada puede ser visualizado y formado la imagen. Por lo general detener la cultura en este punto ya explantes comienzan a mostrar signos de disminución de la viabilidad a largo incubaciones. Un colorante vital tal como naranja de acridina o azul de tripano también se puede utilizar para comprobar la viabilidad de los explantes.
15. En este punto, las imágenes pueden ser adquiridas para documentar la distancia y el número de células que migran desde el explante. Alternativamente, si explantes se sembraron en cubreobjetos,que puede ser fijo y los análisis inmunohistoquímicos realiza para visualizar las proteínas de interés.

Los pasos críticos en el protocolo

1. Cortar explantes de aproximadamente el mismo tamaño.
2. Borrar todos los residuos disección de la placa de disección como está disección para evitar escombros confuso con el tejido deseado explantado.
3. Cuando explantes enchapado en pozos o en cubreobjetos asegúrese de colocar las gotas de los medios de comunicación con explante en el centro del pozo.
4. Permitir explantar tiempo suficiente para fijar antes de inundar el bien con los medios de comunicación.
5. Condiciones de tratamiento deben ser estandarizados para cada sustrato de ensayo y el agente farmacológico utilizado.
6. Dos explantes se pueden hacer de cada embrión (uno de la izquierda y uno de la derecha del tubo neural).
7. Cuando evaluar la migración de células de líneas de ratones mutantes en diferentes condiciones experimentales, poner un explante mutante en el grupo de control y el otro en el grupo tratado.

Solución de problemas

1. Si explantes no adjuntar, aumentar el tiempo asignado para su fijación. En nuestra experiencia, aproximadamente la mitad de los explantes no dan grandes explantes y se adhieren de manera más eficiente.
2. Si explantes se adhieren a la periferia del bien que va a ser difícil de imagen. Asegúrese de colocar los explantes en el centro del pozo.
3. Idealmente explantes será de aproximadamente el mismo tamaño. Sin embargo, las diferencias en tamaño del explante se puede corregir para usar el diámetro de los explantes como un factor de corrección cuando quanitating migraciones de células de explantes.
4. Si se produce contaminación estar seguro estériles condiciones de trabajo están siendo utilizados. Todas las herramientas y superficies de trabajo deben ser esterilizados con 70% de etanol. Pipetas y placas de Petri debe ser nuevo y estéril.
5. Si explantes se están perdiendo durante la disección, periódicamente remueven escombros para evitar la pérdida de explante.
6. El dominio de la disección es mucho tiempo y requiere práctica. Optimal de aumento, herramientas disección cortante y ayuda agujas.

Resultados

La aparición de células que migran a partir de explantes mesénquima craneales se muestra en la Figura 2. Hemos probado la migración sobre sustratos de ECM distintos que están presentes en el mesénquima craneal durante neurulación incluyendo fibronectina (100 mg / ml, Sigma # F1141), laminina (100 mg / ml, Sigma # L2020), ECM MaxGel (1:500 dilución en DMEM , Sigma # E0282) y ácido hialurónico (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Las células no migran desde el explante cuando no está presente ECM (datos no mostrados) y todos los sustratos probados migración de las células de apoyo. Tanto la forma, así como los tamaños de las células que migran desde los explantes depende del sustrato. Esto se espera que los estudios anteriores demuestran que las fuerzas mecánicas generadas por la interacción de las células con ECM diferente afectar tanto a la forma y las propiedades migratorias de las células ^21.

Figura 1. Preparación de explantes. (A) Preparar explantes, E8.5 embriones disecados de deciduas y tejidos extraembryonic. (B) los jefes de embriones se disecan de la parte anterior del cuerpo de los rhombomeres. Los explantes se preparan mediante la eliminación de tejido de la línea media y los bordes exteriores de la cabeza para eliminar la placa precordal en la línea media y la cresta neural y el ectodermo premigratorias superficie en la frontera, respectivamente. (C) Los explantes se prepararon cortando el tejido de los bordes de la línea media y exterior de la cabeza para eliminar la placa precordal en la línea media y la cresta neural y el ectodermo premigratorias superficie en las fronteras. (D) Los explantes se colocan en un pequeño volumen de medios de comunicación en platos recubiertos de ECM / cubreobjetos y se dejan adherir antes de la adición de más medios de comunicación.

Figura 2. Los explantes de migración de células mesenquimales craneales de explantes chapada en diferentes sustratos. Se sembraron en fibronectina, laminina, ECM MaxGel o ácido hialurónico y se fotografiaron después de 48 h en cultivo. Tamaño bar = 200 mm.

Discusión

El método aplicado aquí proporciona un ensayo de gran alcance para examinar el comportamiento de células mesenquimales craneales. Además de los análisis estáticos presentados aquí, vivir experimentos de imagen en campo claro o en combinación con la expresión de proteínas GFP-etiquetados pueden emplearse para examinar el comportamiento de las células en tiempo real a medida que migran desde el explante. Para los experimentos de imagen en vivo, los explantes pueden ser etiquetados con Dil o para diferenciar la migración de la cresta neural del mesodermo paraxial, ROSA-YFP; Mesp1-cre o YFP-ROSA; Wnt1 cre-o de otras líneas transgénicas podrían utilizarse. Craneales ECM mesénquima-interacciones también pueden ser examinados utilizando este ensayo de explante. Aquí explantes de placas en sustratos de ECM diferentes que están presentes en el mesénquima craneal para demostrar que las células migran sobre estos en diferentes grados y que el ECM influye en la morfología de las células. Además, los explantes pueden ser embebidos en una matriz tridimensional para acceder a los comportamientos de cells en este contexto. Este ensayo de explante es modificable para el análisis del efecto de las manipulaciones genéticas y farmacológica sobre comportamientos mesénquima craneales para analizar señales intrínsecos y extrínsecos que pueden regular y modificar la migración. Por ejemplo, se utilizó este ensayo en nuestros estudios para discernir la función del exceso de secreción de Hsp90 en los comportamientos celulares anormales en Hectd1 mesénquima mutante craneal ^15. En estos experimentos, se trataron explantes con anticuerpo anti-Hsp90, Hsp90 proteínas, geldanamicina y DMA (amelioride dimetil) para bloquear la secreción de Hsp90 para demostrar que el comportamiento anormal de células mutantes Hectd1 es debido al exceso de Hsp90 extracelular ^15. Enfoques similares se podrían utilizar para diseccionar farmacológicamente vías adicionales que subyacen a la morfogénesis normal o anormal del mesénquima craneal. Una vez que el ensayo se haya completado, los explantes y células migratorias pueden ser analizadas por una serie de métodos. Por ejemplo, los análisis inmunohistoquímico cun ser empleados para examinar la localización de proteínas críticas para los movimientos celulares. Transcriptome análisis también podría ser empleado para determinar cómo los tratamientos afectan la expresión génica.

Una limitación importante de esta técnica es que no hace comportamientos del modelo en tres dimensiones, ya que se producirían in vivo. Modificación del protocolo donde explantes se incrustan en una matriz de tres dimensiones (por ejemplo, Matrigel) junto con la expresión de proteínas fluorescentes marcados-compartimentos celulares podrían ser empleados necesario para abordar esta cuestión. Incluso si estas modificaciones se llevaron a cabo, más experimentos para correlacionar comportamientos observados en este ensayo ex vivo con aquellos in vivo sería necesario. Otras limitaciones incluyen el gran número de embriones necesarios para generar un número suficiente para generar datos estadísticamente significativas. Lo más importante, la disección es relativamente simple, requiere práctica para dominar.