El uso de LysoTracker para detectar la muerte celular programada en embriones y la diferenciación de células madre embrionarias

Resumen

Se presenta un protocolo simple de visualizar regiones de la muerte celular programada (PCD) en embriones de ratón y diferenciadores madre embrionarias (ES) de cultivos de células utilizando un colorante altamente soluble llamada LysoTracker.

Resumen

La muerte celular programada (PCD) se produce en adultos para mantener la homeostasis del tejido normal y durante el desarrollo embrionario para dar forma a los tejidos y órganos ^1,2,6,7. Durante el desarrollo, los productos químicos tóxicos o alteraciones genéticas pueden causar un aumento en la PCD o cambiar los patrones resultantes de PCD en anomalías en el desarrollo y defectos de nacimiento ^3-5. Para entender la etiología de estos defectos, el estudio de los embriones puede complementarse con ensayos in vitro que utilizan diferenciar madre embrionarias (ES) de células.

La apoptosis es una forma bien estudiado de PCD, que implica tanto intrínseca y extrínseca de señalización para activar la cascada de enzimas caspasas. Cambios característicos celulares incluyen formación de ampollas en la membrana, contracción nuclear y la fragmentación del ADN. Otras formas de PCD no implican la activación de caspasas y puede ser el resultado final de la autofagia prolongado. Independientemente de la vía de PCD, las células que mueren necesitan ser removidos. En los adultos, las células inmunes performe esta función, mientras que en los embriones, donde el sistema inmune todavía no se ha desarrollado, la eliminación se produce por un mecanismo alternativo. Este mecanismo consiste en células vecinas (llamados "no profesionales" fagocitos) que asumen un papel fagocítico-reconocen la "cómeme" señal en la superficie de la célula que muere y lo engullen ^8-10. Después de inmersión, los escombros se lleva a los lisosomas para degradación. Así, independientemente del mecanismo PCD, un aumento de la actividad lisosomal se puede correlacionar con una mayor muerte celular.

Para el estudio de PCD, un ensayo simple de visualizar los lisosomas en los tejidos gruesos y multicapa culturas diferenciadoras pueden ser útiles. LysoTracker colorante es una molécula pequeña altamente soluble que es retenido en ácidos compartimentos subcelulares tales como el lisosoma ^11-13. El colorante es absorbido por difusión y por medio de la circulación. Dado que la penetración no es un obstáculo, la visualización de la CPD en los tejidos gruesos y las culturas de varias capas es posible ^12,13 14, se limita a muestras pequeñas, secciones histológicas, y cultivos en monocapa debido a que el procedimiento requiere la entrada / permeabilidad de una transferasa terminal.

En contraste con azul de anilina, que se difunde y se disuelve por disolventes, LysoTracker Red DND-99 se puede fijar, brillante y estable. La tinción puede ser visualizada con microscopía confocal fluorescente estándar o en todo el montaje o sección utilizando medio de montaje acuoso o de disolvente ^12,13. Aquí se describen los protocolos que utilizan este medio de contraste para ver la CPD en normal y sonic hedgehog embriones de ratones nulos. Además, se demuestra el análisis de PCD en la diferenciación de cultivos de células ES y presentar un método de cuantificación simple. En resumen, la tinción LysoTracker puede ser un gran complemento a otros métodos de detección de PCD.

Protocolo

1. LysoTracker tinción de embriones de ratón

1. Generar embriones de ratón mediante la colocación de jóvenes (5-6 semanas de edad) las hembras en jaulas de prisioneros masculinos. Monitorear la mañana siguiente para la aparición de un tapón vaginal que indica que se ha producido el apareamiento. Si la mujer está embarazada, el mediodía de ese día se llama 0,5 dpc (coito días después). El procedimiento que aquí se presenta es ideal para los embriones 13.7 dpc.
2. En el día embrionario de interés, la eutanasia a la hembra de acuerdo con los protocolos aprobados y quitar el útero. Retire los embriones de la decidua en una placa de Petri de 10 cm con Hanks....

Discusión

Características importantes de la apoptosis incluyen la detección de daños en el ADN con el ensayo TUNEL, junto con la detección de la actividad caspasa (detectada con mAbs o una molécula de unión tal como zVAD-fmk), la observación de los cambios celulares, y la presentación de la fosfatidilserina (PS ) en la superficie de la membrana (detectado por Anexina V vinculante). Hay algunas desventajas con cada uno de estos ensayos. Por ejemplo, la transferasa terminal utilizado en el ensayo de TUNEL no penetra más allá de una.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa		Número de catálogo
LysoTracker Red NOM-99	Invitrogen	# L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehído	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013 CV-
No esenciales de aminoácidos	Cellgro	25 a 025-CI
Piruvato de sodio	Cellgro	25 a 000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-mercaptoetanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
Labtek-II de la Cámara portaobjetos (8-bien)	Nalge Nunc Internacional	154534
0,1% de gelatina	Millipore	ES-006-B
PBS de Dulbecco (D-PBS)	Cellgro	21-031 CV-
			Recetas de Soluciones 4% de paraformaldehído Para 100 ml: Mezclar 4 g de paraformaldehído, 90 ml de H 2 O, y NaOH (una gota de NaOH 2 N). El paraformaldehído no se disolverá hasta que haya añadido algún NaOH para aumentar el pH. Se agita y se calienta a 60 ° C hasta que todo el polvo está en solución (~ 10-20 min). No sobrecaliente. Añadir ~ 10 ml 10x PBS para obtener un volumen final de 100 ml. Almacenar a -20 ° C en conveniente (~ 10 ml o 40 ml) ~ alícuotas. ADVERTENCIA: paraformaldehído en 'volante' forma (pequeños gránulos comprimidos) es menor en polvo y por lo tanto puede ser medido fuera de una campana. Sin embargo, usted todavía debe usar una máscara protectora contra el polvo (N95por lo menos) durante la manipulación. EB Cultura Medios Para 500 ml de medio EB: DMEM: 404,5 ml FBS: 75,0 ml L-Glutamina: 5,0 ml Penicilina / Estreptomicina: 5,0 ml No esenciales de aminoácidos: 5,0 ml Piruvato de sodio: 5,0 ml β-mercaptoetanol: 500l