Examinando familia Bcl-2 Función con grandes vesículas unilamelares

Resumen

Las vesículas unilaminares grandes definidas bioquímicamente (LUVs) son un sistema modelo conveniente para analizar las interacciones de la familia BCL-2, con implicaciones directas en el mejor entendimiento de la vía mitocondrial de la apoptosis. Se presenta un método para producir LUVs, junto con combinaciones estándar de proteínas de la familia BCL-2 y controles para examinar la permeabilización de LUVs.

Resumen

La familia BCL-2 (linfoma/leucemia de células B) está compuesta por aproximadamente veinte proteínas que colaboran para mantener la supervivencia celular o bien iniciar la apoptosis¹. Tras un estrés celular (por ejemplo, daño en el ADN), los efectores proapoptóticos de la familia BCL-2, BAK (asesino antagonista de BCL-2 1) y/o BAX (proteína asociada a BCL-2 X), se activan y comprometen la integridad de la membrana mitocondrial externa (MME), mediante un proceso denominado permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MMEP)¹. Tras la ocurrencia de la MMEP, las proteínas proapoptóticas (por ejemplo, citocromo c) acceden al citoplasma, promueven la activación de caspasas y se inicia rápidamente la apoptosis².

Para que BAK/BAX induzcan la MOMP, requieren interacciones transitorias con miembros de otro subconjunto proapoptótico de la familia BCL-2, las proteínas solo del dominio homólogo a BCL-2 (BH3), como BID (agonista del dominio interaccionante con BH3)^3-6. Las proteínas antiapoptóticas de la familia BCL-2 (por ejemplo, gen relacionado con BCL-2, isoforma larga, BCL-xL; leucemia de células mieloides 1, MCL-1) regulan la supervivencia celular mediante el control estricto de las interacciones entre BAK/BAX y las proteínas solo de BH3 capaces de inducir directamente la activación de BAK/BAX^7,8. Además, la disponibilidad de las proteínas antiapoptóticas BCL-2 también está determinada por las proteínas solo de BH3 sensibilizadoras/desrepresoras, como BAD (antagonista de la muerte celular de BCL-2) o PUMA (modulador regulado positivamente por p53 de la apoptosis), que se unen e inhiben a los miembros antiapoptóticos^7,9. Dado que la mayor parte del repertorio de BCL-2 antiapoptóticas se localiza en la MOM, la decisión celular de mantener la supervivencia o inducir la MOMP está dictada por múltiples interacciones de la familia BCL-2 en esta membrana.

Vesículas unilamelares grandes (LUVs) son un modelo bioquímico para explorar las relaciones entre las interacciones de la familia BCL-2 y la permeabilización de membranas¹⁰. Las LUV están compuestas por lípidos definidos que se ensamblan en proporciones determinadas a partir de estudios de composición lipídica realizados con mitocondrias de Xenopus extraídas con disolvente (46,5 % de fosfatidilcolina, 28,5 % de fosfatidiletanolamina, 9 % de fosfatidilinositol, 9 % de fosfatidilserina y 7 % de cardiolipina)¹⁰. Este es un sistema modelo conveniente para explorar directamente la función de la familia BCL-2, ya que los componentes proteicos y lipídicos están completamente definidos y son manejables, lo cual no siempre ocurre con las mitocondrias primarias. Aunque la cardiolipina normalmente no alcanza niveles tan elevados en toda la membrana mitocondrial externa (OMM), este modelo sí imita fielmente la OMM para favorecer la función de la familia BCL-2. Además, una modificación más reciente del protocolo anterior permite realizar análisis cinéticos de interacciones proteicas y mediciones en tiempo real de la permeabilización de la membrana, basados en LUVs que contienen un colorante policatiónico (ANTS: 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfónico) y un agente apagador catiónico (DPX: p-bromuro de xileno-bis-piridinio)¹¹. A medida que las LUV se vuelven permeables, ANTS y DPX se difunden separándose, y se detecta un aumento en la fluorescencia. A continuación se describen combinaciones comunes de proteínas recombinantes de la familia BCL-2 y controles utilizados con las LUV que contienen ANTS/DPX.

Protocolo

1. Combinar lípidos y crear una película lipídica

1. Trabajando en una campana extractora con iluminación mínima, se combinan lípidos solubilizados en cloroformo en un vial de vidrio ámbar de 1,5 ml utilizando una jeringa de vidrio hermética para gases de Hamilton enjuagada con cloroformo. Esta combinación producirá aproximadamente 4 mg de lípido (Figura 1A).
   • Cardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl
   • Fosfatidilcolina 10 mg/ml (PC) - 84 μl
   • Fosfatidiletanolamina 10 mg/ml (PE) - 125 μl
   • Fosfatidilinositol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl
   • Fosfatidilserina 10 mg/ml (PS) - 65 μl
2. Para e....

Discusión

El método descrito para generar LUV permite un medio rápido y eficiente para probar la función de diversas proteínas de la familia BCL-2, péptidos y reactivos relacionados en un entorno de membrana definido bioquímicamente, similar al de la MIO. Si se utilizan valores puntuales para determinar la permeabilización de LUV, se pueden preparar múltiples placas para analizar cientos de condiciones en un solo día. Consideramos que los reactivos limitantes en estos ensayos suelen ser la calidad y cantidad de las proteínas recom.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE"	Avanti	850725C
Fosfatidilcolina L-α (Huevo, Pollo) "PC"	Avanti	840051C
Fosfatidilinositol L-α (Hígado, Bovino) "PI"	Avanti	840042C
Fosfatidilserina L-α (Cerebro, Porcino) "PS"	Avanti	8400320
Cardiolipina (Corazón, Bovino - Sal sódica) "CL"	Avanti	840012C
Juego de miniextrusor	Avanti	610023
Membrana de PC 0,2 mM	Avanti	610006
Placa negra Costar de 96 pocillos	Fisher Scientific	07-200-590
BID humano escindido por caspasa-8	R&D Systems	882-B8-050
BCL-xL humano (sin extremo C-terminal)	R&D Systems	894-BX-050
Péptidos de dominio BH3 de BID/PUMA	Anaspec	61711/62404
Lector microplacas híbrido Synergy H1 de múltiples modos	BioTek	None