Las vesículas unilaminares grandes definidas bioquímicamente (LUVs) son un sistema modelo conveniente para analizar las interacciones de la familia BCL-2, con implicaciones directas en el mejor entendimiento de la vía mitocondrial de la apoptosis. Se presenta un método para producir LUVs, junto con combinaciones estándar de proteínas de la familia BCL-2 y controles para examinar la permeabilización de LUVs.
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Artículo de método
Examinando familia Bcl-2 Función con grandes vesículas unilamelares
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Resumen
Resumen
La familia BCL-2 (linfoma/leucemia de células B) está compuesta por aproximadamente veinte proteínas que colaboran para mantener la supervivencia celular o bien iniciar la apoptosis1. Tras un estrés celular (por ejemplo, daño en el ADN), los efectores proapoptóticos de la familia BCL-2, BAK (asesino antagonista de BCL-2 1) y/o BAX (proteína asociada a BCL-2 X), se activan y comprometen la integridad de la membrana mitocondrial externa (MME), mediante un proceso denominado permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MMEP)1. Tras la ocurrencia de la MMEP, las proteínas proapoptóticas (por ejemplo, citocromo c) acceden al citoplasma, promueven la activación de caspasas y se inicia rápidamente la apoptosis2.
Para que BAK/BAX induzcan la MOMP, requieren interacciones transitorias con miembros de otro subconjunto proapoptótico de la familia BCL-2, las proteínas solo del dominio homólogo a BCL-2 (BH3), como BID (agonista del dominio interaccionante con BH3)3-6. Las proteínas antiapoptóticas de la familia BCL-2 (por ejemplo, gen relacionado con BCL-2, isoforma larga, BCL-xL; leucemia de células mieloides 1, MCL-1) regulan la supervivencia celular mediante el control estricto de las interacciones entre BAK/BAX y las proteínas solo de BH3 capaces de inducir directamente la activación de BAK/BAX7,8. Además, la disponibilidad de las proteínas antiapoptóticas BCL-2 también está determinada por las proteínas solo de BH3 sensibilizadoras/desrepresoras, como BAD (antagonista de la muerte celular de BCL-2) o PUMA (modulador regulado positivamente por p53 de la apoptosis), que se unen e inhiben a los miembros antiapoptóticos7,9. Dado que la mayor parte del repertorio de BCL-2 antiapoptóticas se localiza en la MOM, la decisión celular de mantener la supervivencia o inducir la MOMP está dictada por múltiples interacciones de la familia BCL-2 en esta membrana.
Vesículas unilamelares grandes (LUVs) son un modelo bioquímico para explorar las relaciones entre las interacciones de la familia BCL-2 y la permeabilización de membranas10. Las LUV están compuestas por lípidos definidos que se ensamblan en proporciones determinadas a partir de estudios de composición lipídica realizados con mitocondrias de Xenopus extraídas con disolvente (46,5 % de fosfatidilcolina, 28,5 % de fosfatidiletanolamina, 9 % de fosfatidilinositol, 9 % de fosfatidilserina y 7 % de cardiolipina)10. Este es un sistema modelo conveniente para explorar directamente la función de la familia BCL-2, ya que los componentes proteicos y lipídicos están completamente definidos y son manejables, lo cual no siempre ocurre con las mitocondrias primarias. Aunque la cardiolipina normalmente no alcanza niveles tan elevados en toda la membrana mitocondrial externa (OMM), este modelo sí imita fielmente la OMM para favorecer la función de la familia BCL-2. Además, una modificación más reciente del protocolo anterior permite realizar análisis cinéticos de interacciones proteicas y mediciones en tiempo real de la permeabilización de la membrana, basados en LUVs que contienen un colorante policatiónico (ANTS: 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfónico) y un agente apagador catiónico (DPX: p-bromuro de xileno-bis-piridinio)11. A medida que las LUV se vuelven permeables, ANTS y DPX se difunden separándose, y se detecta un aumento en la fluorescencia. A continuación se describen combinaciones comunes de proteínas recombinantes de la familia BCL-2 y controles utilizados con las LUV que contienen ANTS/DPX.
Protocolo
1. Combinar lípidos y crear una película lipídica
- Trabajando en una campana extractora con iluminación mínima, se combinan lípidos solubilizados en cloroformo en un vial de vidrio ámbar de 1,5 ml utilizando una jeringa de vidrio hermética para gases de Hamilton enjuagada con cloroformo. Esta combinación producirá aproximadamente 4 mg de lípido (Figura 1A).
- Cardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Fosfatidilcolina 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Fosfatidiletanolamina 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Fosfatidilinositol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl
- Fosfatidilserina 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- Para eliminar el cloroformo, aplique un flujo suave de un gas inerte (por ejemplo, nitrógeno o argón) dentro del vial. Una película lipídica será visible en el fondo y las paredes del vial cuando esté seco, lo cual normalmente toma de 2 a 3 horas (Figura 1A).
2. Preparar la solución de liposomas
- En tubos microcentrífugos de 1,7 ml, prepare 500 μl de ANTS 12,5 mM en tampón LUV (EDTA 0,2 mM, HEPES 10 mM [pH 7], KCl 200 mM, MgCl2 5 mM) y 500 μl de DPX 45 mM en tampón LUV (Figura 1B).
- Combine las soluciones de ANTS y DPX, vortexee durante 1 min y sonicar durante 1 min a temperatura ambiente. La sonicación se realiza en un baño de agua ultrasónico (por ejemplo, Branson 3510MTH, sin ajuste, simplemente encendido). Esto asegura que las soluciones estén completamente solubilizadas y homogéneas.
- Añada la solución de ANTS/DPX a la película lipídica y selle el vial con parafilm (Figura 1B).
- Sonicar la película lipídica en el baño de agua anterior durante 5 min. La solución aparecerá lechosa tras la sonicación. Asegúrese de que la película lipídica se haya solubilizado completamente, ya que los agregados lipídicos pequeños afectarán negativamente los pasos siguientes. Además, revise los lados y el fondo del vial para asegurarse de que no quede ninguna película lipídica residual (Figura 1B).
3. Extrusión y purificación de liposomas
- Arme el extrusor según las instrucciones del fabricante, utilizando tampón LUV para humedecer los soportes del filtro y la membrana de policarbonato. Ajuste la carcasa del equipo de manera que no haya pérdida de volumen durante la extrusión, pero sin apretar en exceso para no romper la membrana. También es recomendable probar el extrusor con tampón LUV para asegurarse de que no haya fugas ni problemas.
- Comience con la solución lipídica en la jeringa derecha y extruya la solución lipídica 31 veces; al finalizar, las LUV quedarán en la jeringa izquierda. Esto garantiza que todos los lípidos hayan pasado por lo menos una vez a través de la membrana. Las primeras veces pueden requerir un poco más de presión para atravesar la membrana. Si la solución pasa repentinamente con mucha rapidez a través de la membrana, verifique si esta se ha roto y reemplácela si es necesario (Figure 1C).
- Prepare una columna de flujo por gravedad de Sepharose S-500 de 10 ml (1,0 cm x 20 cm, con un volumen de perlas de 10 ml). Lave con 3 volúmenes de columna de tampón LUV, permita que el flujo de la columna se detenga y tápela. Dado que este paso lleva cierto tiempo, es preferible comenzar el lavado cuando los lípidos se estén secando. Mantenga la columna tapada hasta que esté listo para usarla.
- Agregue las LUV extruidas a la columna en un solo paso, evitando perturbar la interfaz de las perlas. Permita que el tampón salga de la columna; el flujo se detendrá y entonces tápela. Llene suavemente la columna con tampón LUV. Nuevamente, tenga cuidado al agregar el tampón para no perturbar las perlas (Figure 1C).
- Retire el tapón y recoja 6 fracciones de 1 ml cada una. Normalmente, las LUV eluyen en las fracciones 3 y 4, y pueden identificarse por su aspecto turbio. Una vez recolectadas las fracciones, lave la columna con 5 volúmenes de agua y 2 volúmenes de etanol al 20 %. Almacene la columna a 4 °C (Figure 1C).
- Almacene las fracciones a 4 °C y en la oscuridad hasta que se analicen.
4. Probar las fracciones de la columna
- Las fracciones de la columna se ensayan ahora para detectar fluorescencia, comparando el tampón de LUV con el tampón de LUV suplementado con 0,5 % de CHAPS. Las fracciones que muestran un incremento en fluorescencia debido a la presencia de CHAPS contienen LUVs. Pipetee 100 μl de tampón de LUV o tampón de LUV + 0,5 % de CHAPS en seis pocillos cada uno, y agregue 5 μl de la fracción correspondiente, luego mezcle. Utilice placas de 96 pocillos opacas, negras y no tratadas para todos los estudios con LUVs (Figure 1D).
- Lea la placa a 37 °C con los siguientes parámetros: longitud de onda de excitación: 355 nm; longitud de onda de emisión: 520 nm; ganancia (voltaje): 125; posición de los elementos ópticos: superior; altura de lectura: 5,5 mm. Esta configuración es para el equipo BioTek H1 Synergy utilizando el software Gen 5 2.0 (Figure 1D).
- Generalmente, las fracciones 3 y 4 muestran un aumento de 5 a 10 veces en la fluorescencia. Tras el análisis, combine las fracciones que contienen LUVs y almacénelas a 4 °C en la oscuridad; se purificará aproximadamente 2 ml de lípido a ~ 2 mM (Figure 1D).
5. Estudios de la familia BCL-2 utilizando LUVs
- Se evalúa la capacidad de las proteínas BCL-2 para inducir directamente la permeabilización de LUV y para regular la actividad de permeabilización. Los ensayos con LUV se realizan normalmente en volúmenes de 100 μl, a 37 °C, y pueden analizarse en un único punto temporal tras 30 - 60 min (Figuras 2A-C, 3A-B), o mediante estudios cinéticos cada 1 - 2 min durante hasta 1 h (Figura 2D). Se proporciona un diseño representativo del ensayo que describe los componentes, las concentraciones stock y finales, y el orden de adición (Tabla 1). También es recomendable que el lector de microplacas agite suavemente la placa antes de cada lectura. Los primeros minutos a menudo producen lecturas esporádicas (probablemente debido a cambios de temperatura, mezcla, etc.), por lo que generalmente consideramos los puntos de datos tras las 2 - 3 primeras lecturas en un estudio cinético. Asimismo, no es infrecuente obtener barras de error grandes en algunas condiciones debido a la variabilidad entre lotes de LUV y a la eficiencia de las interacciones proteicas en concentraciones límite de activación o inhibición.
- Los stocks de proteínas de la familia BCL-2 deben diluirse en tampón para LUV a una concentración 100x, y deben realizarse las titulaciones necesarias de BAX, BID y todas las demás proteínas para determinar las concentraciones mínimas necesarias para detectar una permeabilización mínima de LUV dependiente de BAX en ausencia de BID, y una sinergia significativa entre BAX y BID. Además, todas las demás proteínas requieren titulaciones para reducir el desperdicio de proteína y minimizar las concentraciones de adiciones proteicas posteriores.
6. Resultados representativos
Existen una miríada de opciones para observar y examinar la regulación dependiente de la familia BCL-2 en la permeabilización de LUV. Para generar un control positivo de permeabilización de LUV, utilizamos BAX activado con detergente12. El detergente, n-octil-β-D-glucósido (OG), activa artificialmente BAX (para 100 μl de BAX-OG al 2,3 μM: 5 μg de BAX + 0,7 % de OG en tampón LUV, incubar durante 60 min a 4 °C, alícuotas y almacenar a -80 °C), por lo tanto, BAX-OG (10 - 100 nM) puede utilizarse como un control positivo confiable. Cabe señalar que las concentraciones de OG inferiores al 0,025 % no afectan directamente la permeabilización de LUV. Un tratamiento con CHAPS al 0,5 % se utiliza para determinar la cantidad máxima de fluorescencia de LUV por ensayo, y este valor establece el 100 %. Todos los tratamientos deben realizarse por triplicado. En el Tabla 1 se muestra un ejemplo de configuración de ensayo de control de LUV, y los datos correspondientes se presentan en la Figura 2A.
Un punto de partida necesario para estudiar la permeabilización de LUV con proteínas de la familia BCL-2 es establecer las concentraciones de BAX y BID que promuevan una liberación óptima. Dado que distintas preparaciones individuales de proteínas mostrarán actividades de permeabilización basal diferentes, es recomendable realizar una titulación antes de iniciar análisis más sofisticados. Se deben titular BAX (50 - 200 nM) y BID (0 - 10 nM) para lograr una liberación basal mínima y una sinergia óptima, como se muestra en Figuras 2B-C, respectivamente. Se pueden adquirir diversas formas de la proteína BID de R&D Systems; alternativamente, el péptido del dominio BH3 de BID está disponible en Anaspec. No existe una forma comercial de BAX adecuada para ensayos con LUV, por lo tanto debe expresarse y purificarse utilizando métodos publicados3,13.
Una vez establecidas las concentraciones de BAX y BID y su sinergia, un ensayo común consiste en determinar la influencia de las proteínas antiapoptóticas sobre la permeabilización de LUV dependiente de BAX y BID. BCL-xL es un miembro antiapoptótico de la familia BCL-2 disponible comercialmente que, de manera dependiente de la dosis, inhibe la actividad de BAX y BID, generalmente en un rango de exceso molar de 5 a 10 veces respecto a BAX o BID (Figura 3A). Este efecto inhibitorio puede revertirse mediante la adición de proteínas BH3-sólo subsiguientes (exceso molar de 2 a 5 veces respecto a BCL-xL) o péptidos del dominio BH3 (exceso molar de 5 a 10 veces respecto a BCL-xL), que se unen a BCL-xL, permitiendo así que BAX y BID actúen de forma sinérgica y permeabilicen las LUV (Figura 3B). En la Figura 3B, se muestra el efecto de la proteína recombinante humana PUMAβ de longitud completa, y se observa que el péptido del dominio BH3 de PUMA es funcionalmente similar (datos no mostrados)8. Este experimento se conoce comúnmente como «ensayo de desrepresión», ya que la proteína PUMA alivia el efecto inhibitorio de BCL-xL sobre BAX y BID. Idealmente, la adición de la proteína o péptido BH3-sólo desrepresor debería tener efectos mínimos sobre la activación de BAX14.
Figura 1. (A) Los lípidos solubilizados en cloroformo se combinan, se secan para crear una película de lípidos y se tapan. (B) Se preparan las soluciones de ANTS y DPX, se mezclan y se someten a sonicación para asegurar una solubilización y homogeneización completas. La solución se añade a la película de lípidos, el vial se sella con parafilm y se somete a sonicación durante 5 min en un baño de agua. La solución ahora presentará un aspecto lechoso. (C) La solución lipídica sometida a sonicación se carga en el miniextrusor, se procesa 31 veces y se añade a una columna de Sepharosa S-500 preparada para su posterior purificación. (D) Las fracciones obtenidas tras la cromatografía de exclusión por tamaño se analizan comparando las unidades fluorescentes relativas (UFR) en tampón LUV y tampón LUV + 0,5 % CHAPS. La lectura de «tampón LUV» indica la fluorescencia de fondo con LUV intactas; la condición «tampón LUV + 0,5 % CHAPS» mostrará un aumento de fluorescencia inducido por lisis, indicativo de LUV. Generalmente, las fracciones 3 y 4 contienen las LUV y se combinan tras el análisis. Las fracciones 5 y 6 contienen ANTS no incorporado (es decir, no incluido dentro de las LUV tras la extrusión), que muestra alta fluorescencia independientemente del CHAPS. Haga clic aquí para ver la figura en tamaño mayor.
Figura 2. Experimentos de control de la familia BCL-2 y titulaciones de BAX/BID utilizando LUV. (A) Experimentos de control. Los LUV se trataron con tampón de LUV solo, 0,025 % de octilglucósido "OG", 50 nM de BAX o 50 nM de OG-BAX. Los LUV se incubaron durante 60 min a 37 °C. El porcentaje (%) de permeabilización se determina restando la fluorescencia del tratamiento con tampón de todas las muestras; el 100 % de permeabilización se determina con una muestra solubilizada con CHAPS al 0,5 %; se dividen los valores experimentales por el valor de CHAPS para obtener el porcentaje de permeabilización de LUV. OG-BAX es BAX activado por detergente, que constituye un control positivo confiable para la permeabilización de LUV. (B) Determinación de la concentración óptima de BAX. Los LUV se trataron con concentraciones crecientes de BAX (50 - 200 nM) en presencia de 10 nM de C8-BID "BID" o tampón solo. (C) Determinación de la concentración óptima de BID. Los LUV se trataron con concentraciones crecientes de BID (0 - 10 nM) en presencia de 100 nM de BAX. (D) Un ejemplo de un conjunto de datos cinéticos de permeabilización de LUV. Los LUV se trataron con BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Las lecturas se realizaron cada dos minutos durante 30 min, con dos segundos de agitación suave de la placa antes de cada lectura. Las tres primeras lecturas (0, 2 y 4 min) no se incluyen en el gráfico. Las unidades de fluorescencia relativa (RFU) mínima y máxima se determinaron según se describe en la sección 4.3. Las barras de error en las Figuras 2A-C representan la desviación estándar de datos triplicados. Los datos de la figura 2D representan un ensayo duplicado.
Figura 3. Ejemplos de interacciones comunes entre miembros de la familia BCL-2 estudiadas mediante LUV. (A) La permeabilización de LUV mediada por BAX y BID es inhibida por BCL-xL. Las LUV se incubaron con 100 nM de BAX, 10 nM de BID y concentraciones crecientes de BCL-xL (0 - 500 nM). La incubación de las LUV se realizó durante 60 min a 37 °C. (B) PUMA desinhibe a BCL-xL para promover la función de BAX y BID. Las LUV se incubaron con combinaciones de 100 nM de BAX, 10 nM de BID, 500 nM de BCL-xL y PUMA (0 - 2,5 μM) durante 60 min a 37 °C. PUMA se utilizó a 2,5 μM junto con BAX solo. Las barras de error representan la desviación estándar de datos triplicados.
| Orden de adición: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| CONDICIONES | LUV Tampón | OG (0,7 %) | BAX (2,3 μM) | OG-BAX (2,3 μM) | CHAPS (10 %) | LUVs (2 mM) | TOTAL |
| Tampón | 95 μl | 5 μl | 100 μl | ||||
| OG (0,015 %) | 92,83 μl | 2,17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| BAX (50 nM) | 92,83 μl | - | 2,17 μl | 5 μl | 100 μl | ||
| OG-BAX (50 nM) | 92,83 μl | 2,17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| CHAPS (0,5 %) | 90 μl | 5 μl | 5 μl | 100 μl |
Tabla 1. Un ejemplo de ensayo control para determinar el efecto de OG-BAX sobre la permeabilización de LUV.
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Discusión
El método descrito para generar LUV permite un medio rápido y eficiente para probar la función de diversas proteínas de la familia BCL-2, péptidos y reactivos relacionados en un entorno de membrana definido bioquímicamente, similar al de la MIO. Si se utilizan valores puntuales para determinar la permeabilización de LUV, se pueden preparar múltiples placas para analizar cientos de condiciones en un solo día. Consideramos que los reactivos limitantes en estos ensayos suelen ser la calidad y cantidad de las proteínas recom...
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Divulgaciones
No se declararon conflictos de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a todos los miembros del Laboratorio Chipuk por su compañerismo y apoyo. Además, queremos expresar nuestro reconocimiento a Tomomi Kuwana y Donald Newmeyer por desarrollar la base experimental para este trabajo. Este trabajo fue financiado por: NIH CA157740 (para J.E.C.) y un proyecto piloto del NIH P20AA017067 (para J.E.C.). Este trabajo también fue apoyado en parte por una subvención para investigación 5-FY11-74 de la Fundación March of Dimes (para J.E.C.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| Fosfatidilcolina L-α (Huevo, Pollo) "PC" | Avanti | 840051C | |
| Fosfatidilinositol L-α (Hígado, Bovino) "PI" | Avanti | 840042C | |
| Fosfatidilserina L-α (Cerebro, Porcino) "PS" | Avanti | 8400320 | |
| Cardiolipina (Corazón, Bovino - Sal sódica) "CL" | Avanti | 840012C | |
| Juego de miniextrusor | Avanti | 610023 | |
| Membrana de PC 0,2 mM | Avanti | 610006 | |
| Placa negra Costar de 96 pocillos | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| BID humano escindido por caspasa-8 | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| BCL-xL humano (sin extremo C-terminal) | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| Péptidos de dominio BH3 de BID/PUMA | Anaspec | 61711/62404 | |
| Lector microplacas híbrido Synergy H1 de múltiples modos | BioTek | None |
Referencias
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E. BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature. 455, 1076-1081 (2008).
- Dewson, G. To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).
- Dewson, G. Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).
- Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX. Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).
- Kuwana, T. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).
- Chipuk, J. E. Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).
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- Lovell, J. F. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
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- Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization. Cell. 103, 645-654 (2000).
- Du, H. BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak. J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).
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Reimpresiones y permisos
