Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente aplicable a otras In vivo Modelos de enfermedad humana.
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Artículo de método
Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad
En este artículo
Resumen
Resumen
En el núcleo residen los proteomas cuyas funciones están íntimamente vinculadas con la regulación de genes. Núcleos de cardiomiocitos adultos de mamíferos son únicos debido al alto porcentaje de células binucleadas, un estado predominantemente heterochromatic del ADN, y la naturaleza no división de los cardiomiocitos que hace que los núcleos adulto en un estado permanente de interfase. 2 Regulación transcripcional durante el desarrollo y enfermedad han sido bien estudiados en este órgano, 3-5, pero lo que permanece relativamente inexplorado es el papel que desempeñan las proteínas nucleares responsables de empaquetamiento del ADN y la expresión, y cómo estas proteínas controlan los cambios en los programas transcripcionales que ocurren durante la enfermedad. 6 En los países desarrollados mundo, la enfermedad cardíaca es la principal causa de mortalidad tanto en hombres como en mujeres. 7 Insight sobre cómo las proteínas nucleares cooperar para regular la progresión de esta enfermedad es fundamental para avanzar en el tratamiento actual opciones.
La espectrometría de masas es la herramienta ideal para abordar estas cuestiones, ya que permite una anotación imparcial de la cuantificación nuclear proteoma y relativo de cómo la abundancia de estas proteínas cambia con la enfermedad. Si bien se han realizado varios estudios proteómicos para mamíferos complejos de proteínas nucleares, 8-13 hasta hace 14 sólo ha habido un estudio que examina el proteoma nuclear cardíaca, y se considera el núcleo entero, en lugar de explorar el proteoma a nivel de sub-compartimentos nucleares . 15 En gran parte, esta escasez de trabajo se debe a la dificultad de aislar núcleos cardíaco. Núcleos cardiacos ocurren dentro de un rígido y denso de actina-miosina aparato al que están conectados a través de múltiples extensiones desde el retículo endoplásmico, en la medida en que altera la contracción de miocitos su forma general. 16 Además, los cardiomiocitos son 40% mitocondrias en volumen 17 que necessitàtes enriquecimiento del núcleo aparte de los otros orgánulos. Aquí se describe un protocolo para el enriquecimiento nuclear cardíaca y fraccionamiento adicional en compartimentos biológicamente relevantes. Además, los métodos de detalle de la etiqueta libre de disección de espectrometría de masa cuantitativa de estas fracciones-técnicas susceptibles de experimentación in vivo en varios modelos animales y sistemas de órganos en el etiquetado metabólico no es factible.
Protocolo
El flujo de trabajo experimental contiene siete pasos principales (Figura 1). Para cualquier trabajo relacionado con las muestras que se ejecutan en el espectrómetro de masas, el experimentador debe usar una bata de laboratorio, guantes y redecilla para el pelo y tener cuidado para evitar la contaminación por polvo y derramamiento personal de la queratina.
1. Corazón homogeneización y Aislamiento Nuclear
Corazones de ratón se homogeneizó y un intacta núcleos de pellets es aislado (Figura 2).
- Sacrificar el ratón adulto, escindir el corazón, enjuagar en PBS enfriado e....
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Resultados
La figura 4 pone de manifiesto la utilidad de esta forma de cuantificación relativa. Se muestra en el panel de la izquierda son los picos individuales monoisotópicas péptidos (superpuesta de diferentes ratones), que han sido designados como pertenecientes a la proteína HMGB1 (identificados mediante una búsqueda de base de datos). Cada pico, esencialmente un cromatógrafo iónico extrae para el péptido dado, proviene de un ratón diferente. Los grupos representan tres diferentes estados fisiológicos: hipert.......
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Discusión
Existen dos métodos principales para el aislamiento nuclear han sido revisados previamente: 27 una es la técnica Behrens de homogeneizar tejido liofilizado en un disolvente no acuoso y la segunda, una modificación de la que se utiliza aquí, de homogenizar el tejido en un acuosa de sacarosa / solución salina seguido por diferencial o centrifugación en gradiente de densidad.
Subfraccionamiento de los núcleos mediante extracción con ácido en muestras de tejido es una herramienta im.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El laboratorio Vondriska es apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre del NIH y la Fundación Laubisch de la UCLA. EM es beneficiaria de la Jennifer S. Buchwald de Becas de Postgrado en Fisiología de la UCLA; HC es el receptor de una Asociación Americana del Corazón Pre-doctoral Fellowship, MP es el destinatario de un NIH Ruth Kirschstein beca posdoctoral, y SF es el receptor de un NIH K99 Award.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Dulbeco Modificado Medio Eagle | Invitrogen | 11965 | |
| Proteasa pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 m colador | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrótomo | Reichert | ||
| 100CX Electrónica de Transmisión Microscopio | JEOL EE.UU., Inc. | ||
| Oriol | BioRad | 161-0496 | |
| Histona H2A anticuerpo | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 anticuerpo | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenina nucleomarea anticuerpo transportador | Santa Cruz | sc-9299 | |
| Bip anticuerpo | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulina de anticuerpos | Sigma | T1568 | |
| Histona H3 anticuerpo | Abcam | ab1791 | |
| Fibrilarina anticuerpo | Señalización Celular | C12C3 | |
| SNRP70 anticuerpo | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 anticuerpo | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma anticuerpo | BD Biosciences | 554136 | |
| Factor-1 inducible por hipoxia anticuerpo | Novus Productos Biológicos | NB100-469 | |
| BCA ensayo de proteínas | Thermo Scientific | 23227 | |
| Columna de fase inversa | Obj Nuevoective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
Referencias
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P.
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