Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Marcus Gereke; Andrea Autengruber; Lothar Gröbe; Andreas Jeron; Dunja Bruder; Sabine Stegemann-Koniszewski

doi:10.3791/4322

Artículo de método

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

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DOI:

10.3791/4322

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26 de diciembre de 2012

Marcus Gereke¹^,² , Andrea Autengruber¹^,² , Lothar Gröbe³ , Andreas Jeron² , Dunja Bruder¹^,² , Sabine Stegemann-Koniszewski¹

¹Research Group Immune Regulation, Helmholtz Centre for Infection Research, ²Research Group Infection Immunology, Institute of Medical Microbiology, Otto-von-Guericke University , ³Department of Experimental Immunology, Helmholtz Centre for Infection Research

En este artículo

Resumen

Se describe el aislamiento rápido de células primarias de murino de tipo II alveolares epiteliales (AECII) por citometría de flujo negativo de selección. Estos AECII mostrar una alta viabilidad y pureza, y son adecuados para una amplia gama de estudios funcionales y molecular respecto a su función en condiciones respiratorias tales como enfermedades autoinmunes o infecciosas.

Resumen

A lo largo de los últimos años, la contribución de las células alveolares de tipo II epiteliales (AECII) a diversos aspectos de la regulación inmune en el pulmón se ha reconocido cada vez más. AECII se han mostrado participar en la producción de citoquinas en las vías respiratorias inflamadas y actuar incluso como células presentadoras de antígeno tanto en la infección de células T y la autoinmunidad mediada por ^1-8. Por lo tanto, son especialmente interesantes también en contextos clínicos como la hiper-reactividad de las vías respiratorias al exterior y de auto-antígenos, así como infecciones que directa o indirectamente se dirigen AECII. Sin embargo, nuestra comprensión de las funciones inmunológicas detalladas servidos por células alveolares de tipo II epiteliales en el pulmón sano, así como en la inflamación sigue siendo fragmentaria. Muchos estudios sobre la función AECII se realizan a través del ratón o humano líneas de células epiteliales alveolares ^9-12. Trabajo con líneas de células sin duda ofrece una serie de beneficios, tales como la disponibilidad de un gran número of células para análisis extensos. Sin embargo, creemos que el uso de AECII murino primaria permite una mejor comprensión de la función de este tipo de células en procesos complejos tales como la infección o inflamación autoinmune. AECII murino primaria se pueden aislar directamente a partir de animales que sufren de tales condiciones respiratorias, lo que significa que han sido objeto de todos los factores extrínsecos adicionales que juegan un papel en el ajuste analizado. Como ejemplo, AECII viable puede ser aislado de ratones por vía intranasal infectadas con virus de influenza A, que se dirige principalmente a estas células para la replicación ^13. Es importante destacar que, a través de la infección ex vivo de AECII aislado de ratones sanos, los estudios de las respuestas celulares montados sobre la infección puede ser extendido.

El protocolo para el aislamiento de AECII murino primario se basa en la digestión enzimática del pulmón de ratón seguido de etiquetado de la suspensión celular resultante con anticuerpos específicos para CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 y CD16/CD32. AECII granulares se identifica entonces como la dispersión de alta sin marcar y lateral (SSC ^alta) población de células y son separadas por fluorescencia de células activadas por la clasificación ^3.

En comparación con otros métodos de aislamiento de células epiteliales primarias de los pulmones del ratón, nuestro protocolo de aislamiento de citometría de flujo de AECII por selección negativa produce intacta, altamente viable y puro AECII en tiempo relativamente corto. Además, y en contraste con los métodos convencionales de aislamiento por lavado en batea y el agotamiento de los linfocitos a través de la unión del anticuerpo acoplado-perlas magnéticas ^{14, 15,} de citometría de flujo de clasificación de células permite la discriminación por medio de tamaño de celda y granularidad. Dado que la instrumentación para la clasificación de células por citometría de flujo está disponible, el procedimiento descrito se puede aplicar a costes relativamente bajos. Al lado de anticuerpos estándar y enzimas para la desintegración, pulmón, ausencia de reactivos adicionales tales como magnéticaperlas se requiere. Las células aisladas son adecuadas para una amplia gama de estudios funcionales y moleculares, que incluyen el cultivo in vitro de células T y ensayos de estimulación, así como transcriptoma, proteoma o análisis de secretoma ^{3, 4.}

Protocolo

Los detalles relativos a los reactivos y materiales necesarios se enumeran en la tabla al final del protocolo a continuación. Antes de empezar el trabajo, preparar tubos de 15 ml (una por ratón) que contienen 4 ml de dispasa y pre-calentamiento a 37 ° C en un baño de agua. En un bloque de calentamiento, poco calentar pequeñas alícuotas de bajo punto de fusión al 1% de agarosa (en agua) a 95 ° C hasta que la miel y, posteriormente, enfriar a 45 ° C hasta su uso.

1. Preparación del pulmón de ratón

Sacrificar el ratón por asfixia de CO _2. Nota: No realice dislocación cervical, ya que esto lesionar la tráquea de modo que siguiendo los pasos del protocolo, como la instalación de los pulmones con líquido, no se puede realizar con éxito. Asegúrese de que la pérdida de los reflejos nociceptivos.
Pulverizar el ratón con etanol y hacer un corte largo a lo largo de la línea media ventral del cuerpo. Tire de la piel y la piel ventral y posteriormente también cuidadosamente cortar y quitar el peritoneo.
Exsanguinate laratón cortando la vena yugular izquierda y la derecha (Vena yugular), así como la arteria renal (renalis Arteria). Quite la sangre que fluye con el tejido.
Con cuidado, punción y retire el diafragma para exponer el corazón y los pulmones cortando las costillas. Tenga especial cuidado de no lesionar el pulmón.
Con una cánula 26G y una jeringa de 10 ml llena con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS), la punción del ventrículo derecho del corazón y perfundir el pulmón con PBS hasta que esté libre de sangre.
Corte y retire las glándulas salivales para exponer la tráquea. También con cuidado corte el músculo que rodea la tráquea.
Insertar una cánula permanente 22G en la tráquea, retirar la aguja y empujar el catéter de plástico hacia el pulmón. Fijar el catéter mediante la vinculación de una pequeña pieza de lana alrededor de la tráquea y el catéter.

2. La digestión enzimática del tejido pulmonar

Si se desea, una muestra de líquido de lavado broncoalveolar puede serpreparado por el lavado de los pulmones a través del catéter insertado en la tráquea con PBS o medio antes de la siguiente etapa.

Usando una jeringa de 2 ml, cuidadosamente infundir un volumen máximo de 2 ml de dispasa (de la alícuota ml 4) en el pulmón a través del catéter de modo que todos los lóbulos están totalmente expandido. Intercambiar la jeringa con una jeringa de 1 ml que contiene 0,5 ml de la agarosa licuada y también infundir en el pulmón.
Deje la jeringa en el catéter para evitar el flujo de retorno de la agarosa y cubrir inmediatamente el pulmón con papel de laboratorio del tejido y hielo. Deje que el gel de agarosa durante un par de minutos.
Quitar el papel de seda, hielo, jeringas y catéteres, cortar la tráquea y escindir el pulmón, corazón y timo del pecho. Luego enjuague el pulmón en un plato con PBS y quitar el corazón, el timo y la tráquea restante.
Ponga el pulmón hacia el restante 2 ml de dispasa y se incuba a temperatura ambiente durante 45 min.

3. Preparación del pulmónSuspensión celular

Retire el pulmón de la dispasa y la transfiere en un plato que contiene 7 ml de anticuerpo anti-CD16/32 (1 mg / ml concentración final) en medio DMEM y 100 l DNasa.
Utilizando fórceps, se desintegran completamente el tejido pulmonar tirando de él aparte y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente mientras agitando suavemente en un agitador ajustado a 200 rpm. Si se desea, la suspensión de células se pueden almacenar a 4 º C hasta el siguiente paso.
Se filtra la suspensión celular a través de mallas de nylon primero con 100 micras y 70 micras, posteriormente con 48 micras y 30 micras poros. Tomar cuidado de enjuagar cada malla, así como los tubos y las placas concienzudamente con DMEM para minimizar la pérdida de células y maximizar el rendimiento. Si está puesta en común de muestras, esto se puede lograr aquí pasando posteriormente por suspensiones de células de ratones de un grupo a través del mismo filtro. Cambiar el filtro en caso de obstrucción.
Dependiendo del volumen, transferir el filtrado a uno o más tubos de 50 ml ycentrifugar durante 15 min a 160 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
Resuspender el pellet de células en 2 ml de tampón de lisis de eritrocitos (0,15 M NH ₄ Cl, 0,01 M de KHCO _3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) y terminar rápidamente la lisis por adición de 13 ml de medio DMEM. Transferir la solución a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 12 min a 160 xg y 4 ° C.

4. Antibody tinción para citometría de flujo en células de clasificación

Resuspender las células en 3 ml de cóctel de anticuerpos primaria, preparado en medio DMEM en diluciones adecuadas para la citometría de flujo. (Los anticuerpos fueron ajustado previamente para diluciones de trabajo óptimas mediante la tinción de 1 x 10 ⁶ esplenocitos en un volumen de 100 l. Uso 3 ml del cóctel de anticuerpo primario que contiene las concentraciones óptimas para cada uno de los anticuerpos utilizados para células agrupadas de hasta cinco ratones. Si más ratones se agruparon para una muestra, ajustar el volumen).
Para la tinción, incubar las células durante 10 min en la oscuridada 4 ° C.
Se lavan las células por el tubo de llenado 15 ml con medio DMEM y centrifugación durante 12 min a 160 xg y 4 º C.
En el caso de anticuerpos biotinilados o no acoplados se utilizaron en 4,1: Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 2 a 3 ml de cóctel de anticuerpo secundario. Teñir durante 10 min a 4 ° C en la oscuridad.
Se lavan las células a través de rellenar el tubo con DMEM y centrifugación durante 12 min a 160 xg y 4 ° C.
Resuspender las células en 1 ml de DMEM y pre-filtro a través de un filtro de 50 micras en un tubo para la clasificación de células. Opcional: Contar las células para obtener el número total de células en la suspensión de células de pulmón.

5. De clasificación de células

Mezclar las células mediante agitación en vórtex antes de la clasificación. Use una boquilla de 100 micras para la célula de clasificación de AECII. La presión de fluido de funda, así como de emisión láser y longitudes de onda de detección dependen del instrumento utilizado para la citometría de flujo de clasificación de células, así como los fluorocromos utilizados en la antibody procedimiento de tinción.
Puerta en las células SSC ^altos que son negativos para los fluorocromos utilizados para la tinción y ordenar en un tubo que contiene DMEM. Utilice altura dispersión hacia adelante (FSC-H) vs área (FSC-A) y la altura de dispersión lateral (SSC-H) vs área (SSC-A) de Windows para excluir los dobletes o agregados celulares (ver detalles de la estrategia de puerta en Figura 1 a).
Con el fin de recoger la centrífuga ordenados células durante 20 min a 280 xg y 4 º C.
Resuspender las células en medio de cultivo o tampón como se requiere para su posterior análisis.