Summary
Det heterologe biosyntese af erythromycin A til
Abstract
Det heterologe produktion af komplekse naturlige produkter er en tilgang designet til at løse de nuværende begrænsninger og fremtidige muligheder. Den er særlig anvendelig til sådanne forbindelser, der har terapeutisk værdi, men kan ikke i tilstrækkelig grad produceret eller vil have gavn af en forbedret form for produktion. De eksperimentelle procedurer på kan opdeles i tre komponenter: 1) genetisk overførsel, 2) heterolog rekonstitution og 3) produkt analyse. Hver eksperimentel komponent er under løbende optimering at møde de udfordringer og foregribe de muligheder, der er forbundet med denne nye tilgang.
Heterolog biosyntesen begynder med identifikation af en genetisk sekvens der er ansvarlig for et værdifuldt naturprodukt. Overførsel af denne sekvens til en heterolog vært kompliceres af biosyntesevejen kompleksitet ansvarlig for produktdannelse. Den antibiotikum erythromycin A er et godt eksempel. Tyve gener (i alt> 50 kb) er påkrævet til endelig biosyntese. Endvidere koder for tre af disse gener megasynthases, multi-domæne-enzymer hver ~ 300 kDa i størrelse. Dette genetiske materiale skal være konstrueret og overført til E. coli for rekonstitueret biosyntese. Anvendelsen af PCR isolation, operon konstruktion, multi-cystronic plasmider, og elektro-transformation vil blive beskrevet overføre erythromycin A genetiske klynge til E. coli.
Når først overføres, E. coli-celle skal understøtte eventuelle biosyntese. Denne proces er også en udfordring på grund af de betydelige forskelle mellem E. coli og mest originale værter ansvar for komplekse naturprodukt dannelse. Cellen skal stille de nødvendige substrater til støtte for biosyntese og koordineret udtrykke det overførte genetiske klynge til at producere aktive enzymer. I forbindelse med erythromycin A, E. coli-celle måtte konstrueres til at tilvejebringe de to forstadier (propionyl-CoA og (2S)-methylmalonyl-CoA), der kræves til biosyntese. Desuden blev gen sekvensmodifikationer, plasmidkopital, chaperonin co-ekspression, posttranslationel enzymatisk modifikation, og procestemperaturen også for at muliggøre endelig erythromycin A formationen.
Endelig skal vellykket produktion vurderes. For erythromycin A tilfældet, vil vi præsentere to metoder. Den første er væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) for at bekræfte og kvantificere produktionen. Bioaktiviteten af erythromycin A vil også blive bekræftet ved anvendelse af et bioassay, hvor den antibiotiske aktivitet testes mod Bacillus subtilis. De vurderingskriterier, assays etablerer erythromycin A biosyntese fra E. coli og satte scenen for den fremtidige tekniske indsats for at forbedre eller diversificere produktionen og til fremstilling af nye komplekse naturlige forbindelser under anvendelse af denne fremgangsmåde.
Introduction
Erythromycin A er et polyketid antibiotikum produceret af Gram-positive jordbakterie Saccharopolyspora erythraea, og nuværende produktion er blevet gradvist forbedret til ~ 10 g / L gennem årtiers traditionel mutagenese og screening protokoller og senere ved procesoptimering ordninger 1-6. Mutagenese og screening strategier er almindelige i antibiotikum naturprodukt udvikling som følge af vanskeligheder i dyrkning og / eller genetisk manipulation af indfødte produktions værter og på grund af den let tilgængelige antibiotisk aktivitet eller forbedrede vækst fænotyper at hjælpe valget. I forbindelse med erythromycin A, S. erythraea er begrænset af en langsom vækst profil og manglen på mere direkte genetiske manipuleringsteknikker (i forhold til organismer som E. coli), således hindrer hurtige forbedringer i produktion og biosyntesen af nye derivater. Efter at have anerkendt de produktionsproblemer og ulåst diversificatipå mulighederne med forbindelser som erythromycin A, begyndte forskerne at forfølge ideen om heterologe biosyntese (figur 1) 7. Disse bestræbelser faldt sammen med tilgængelige sekvensinformation for erythromycin A-genklyngen 8-11. Det skal understreges, at antallet af sekventerede komplekse naturlige produkter genklynger høj grad har udvidet 12-16, giver afsæt for en fortsat indsats i heterolog biosyntese at få adgang til kodet medicinske potentiale. For at gøre dette, heterolog rekonstituering kræver, at den nye vært opfylde behovene i den specifikke biosyntetiske pathway. E. coli giver teknisk bekvemmelighed, en bred spænder sæt molekylærbiologiske teknikker, og metaboliske og procesteknik strategier for produktudvikling. Men sammenlignet med native produktion værter, E. coli udviser ikke den samme grad af komplekse naturprodukt produktion. Det var derfor uvist, om E. coli kunne tjene som en levedygtig heterolog mulighed for komplekse naturprodukt biosyntese. Imidlertid blev det antaget, at E. coli ville være en ideel værtsorganisme, hvis heterologt biosyntese kunne opnås.
Med dette mål for øje, begyndte indledende bestræbelser på at producere den polyketid aglycon 6-deoxyerythronolide B (6dEB) gennem E. coli. Imidlertid nativt E. coli metabolisme kunne ikke give mærkbare niveauer af propionyl-CoA, og (2S)-methylmalonyl-CoA forstadier nødvendige for at støtte 6dEB biosyntese eller kunne den nye vært posttranslationelt modificere deoxyerythronolide B synthase (DEBS) enzymer. For at afhjælpe disse problemer blev en metaboliseringsvej består af indfødte og heterologe enzymer indbygget i E. coli, således at exogent fodret propionat blev omdannet intracellulært til propionyl-CoA, og derefter (2S)-methylmalonyl-CoA, under teknik til at fuldføre denne vej, blev en SFP-gen anbragt i the kromosomet af E. coli BL21 (DE3) til frembringelse af en ny stamme betegnet BAP1. The SFP enzym er en phosphopantetheinyl transferase stand til fastgørelse af 4'-phosphopantetheine cofaktor til Debs enzymer 17,18. De tre Debs gener (hver ~ 10 kb) blev derefter anbragt på to separat valgbare ekspressionsvektorer indeholdende inducerbare T7-promotorer. Efter justeringen af post-induktion temperaturen (til 22 ° C) blev Debs gener koordineret udtrykt i BAP1 i en aktiv tilstand kan generere 6dEB 19.
Forfølgelsen af fuld erythromycin A biosyntesen derefter begyndte at bruge en analog genklyngen fra Micromonospora megalomicea eller en hybrid vej sammensat af gener fra S. erythraea, S. fradiae, og S. venezuelae der producerede den mellemprodukterne erythromycin C og 6-deoxyerythromycin D, henholdsvis 20-22. Senest har vores gruppe udvidet disse bestræbelser ved at producere erythromycin A (den mest klinisk relevant form for erythromycin) gennem E. coli. I modsætning til tidligere arbejde, koordineret vores strategi udtrykte 20 original S. erythraea gener er nødvendige for polyketid biosyntese, deoxysugar biosyntese og fastgørelse, ekstra skrædderi, og selv-modstand (figur 2). I alt blev 26 (native og heterologe) gener manipulerede så E. coli til at producere erythromycin A med 4 mg / L 23,24. Dette resultat er etableret komplet produktion af et komplekst polyketid naturprodukt med E. coli og tjener som grundlag for at udnytte denne nye produktion option eller forfølge nye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Teksten nedenfor er specifikt for erythromycin A antibiotikum, men trinnene er udformet til at være generelt anvendelig til andre naturlige produkter som kandidater til heterolog biosyntese.
1. Erythromycin A Genetic Cluster Transfer
- Design PCR-primere til at amplificere alle de gener, der er forbundet med erythromycin A klynge i S. erythraea kromosom. Dette trin er specifikke for disse naturlige produkter kandidater, hvis genetiske sekvenser er blevet bestemt. Alternativt kan de krævede gener syntetiseres (ved hjælp af flere kommercielle leverandører optioner) med den fordel, at de nyligt syntetiserede gener vil blive designet til optimal kodonanvendelse i den nye E. coli vært. Hvis DNA syntese udøves en strøm udfordring frembringelse megasynthase gener, der kan overstige 10 kb i længden. Teknisk set kan syntesen udføres, men det er udfordrende og dyrt. Det forventes, at kontinuerlig improvemenser i gensyntese teknologi vil løse de nuværende ulemper og yderligere validere denne fremgangsmåde for at give heterolog genetisk materiale.
- Udføre PCR under anvendelse af frisk fremstillet S. erythraea genomisk DNA som en template. Det kromosomale DNA kan fremstilles ud fra kulturer af S. erythraea eller frosne lagre af bakterien (fig. 3) 25. PCR-reaktioner kan drage fordel af tilsætning af DMSO (4 pi i 50 gl reaktioner), som vedrører højt G+ C-indhold i målet S. erythraea gener. Hver amplificeret gen bør sekventeret til bekræftelse af, at hele genet er blevet hentet, og at ingen mutationer er blevet indført under PCR-processen.
- Ved restriktionsfordøjelse og ligering indsætte hvert af de isolerede gener i ekspressionsvektorer designet til E. coli (figur 3). Dette initieres ved at udforme restriktionssteder i PCR-primerne for at tillade fordøjelse og ligering ind i passende expression vektorer (et eksempel er medtaget i figur 3). Vi har brugt både pET21 og pET28 vektorer. Den pET28 vector tillader optagelse af en 5'-ledersekvens, der hjalp genekspression i erythromycin A tilfældet. Bekræft individuelle genekspression via RT-PCR, SDS-PAGE analyse (under anvendelse af opløselige proteinfraktioner), eller bekvemme fænotypiske assays (figur 4).
- Construct operoner baseret på gener med succes udtrykt fra individuelle ekspressionsplasmider (fig. 3). Vi har traditionelt anvendt kombinationer af kompatible-kohæsive restriktionsenzymer (såsom Xba I og Spe I) 24 til sekventielt at omdanne gener for operoner, men skal restriktionssteder valgt til operon konstruktion ikke opholde sig (eller skal fjernes fra) det isolerede gensekvenser (et problem, der kan undgås, hvis gensyntese anvendes). Dette trin styrker på 20 erythromycin A-gener, før E. coli transformation. I øjeblikket har vi brugt denne metode til at omfatte op til 20 kb af fremmed DNA i en standard pET vektor (to gener af ~ 10 kb hver). Desuden har vi brugt denne tilgang til at generere operoner indeholder ni gener. Det vides ikke præcist, hvor meget DNA, eller hvor mange gener kan integreres i pET-typen plasmider, men de målinger ovennævnte tilvejebringe en reference for komplicerede systemer såsom erythromycin biosyntesevejen. Endelig standard in vitro ligering skridt og efterfølgende vellykket transformation trin bliver stadig vanskeligere som operon og plasmid størrelse stiger. Ligering temperatur (12-22 ° C) og tid (3-24 timer) er varierede og elektro-transformation bruges til at støtte fremgangsmåden til fremstilling af de endelige plasmidkonstruktioner.
- Omdanne nydesignede biosyntetiske plasmider ind i E. coli-stamme BAP1 anvendelse af elektro-transformation (figur 5). Proceduren kan forsøges med plasmider indføres enten sekventielt eller sammenmbination. Når transformerende size-stand eller talrige plasmider, har vi traditionelt brugt elektro-transformation (i modsætning til kemisk omdannelse). Når transformeret, plade cellerne på fast LB-medium indeholdende tetracyclin (5 mg / l), carbenicillin (100 mg / l), kanamycin (50 mg / l), streptomycin (50 mg / l), og apramycin (50 mg / l ) for at selektere for plasmidopretholdelse. Det er meget usædvanligt at bruge seks forskellige udvalg antibiotika efter transformation af en E. coli-celle, men dette afspejler blot det samlede antal plasmider er nødvendige for at muliggøre endelig erythromycin A-biosyntese. Mens det er muligt, vil fremgangsmåden begrænse produktionskapacitet af forbindelsen, når dyrkning er begyndt (se nedenfor).
2. E. coli Biosyntetiske Rekonstituering
- Strain BAP1 er designet til at give de nødvendige substrater for biosyntese og at posttranslationelt ændre deoxyerythronolide B megasynthase. Individuelle gener i erythromycin En sti er testet for genekspression og konsolideret som operoner i ekspressionsplasmider. Dette afsnit er dedikeret til dyrkningsbetingelser at teste for samordnet aktivitet af den fulde erythromycin A vej.
- Tag 3 separate kolonier af frisk transformerede BAP1 og inokulere 1,5 ml LB kulturer indeholdende de krævede plasmidselektion antibiotika (ved de samme koncentrationer angivet ovenfor til selektion for transformanter på fast medium), Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG; 100 uM ) og arabinose (2 mg / ml) for at inducere genekspression, og 20 mM natriumpropionat at støtte intracellulær biosyntetisk precursor formation. Når produktionen er blevet bekræftet, kan større kulturer udføres i et forsøg på at skalere og maksimere produktets titre.
- Dyrke cellerne ved 22 ° C og 250 rpm i 24-48 timer. I dette tilfælde sikrer antibiotisk selektion, at de krævede plasmider holdes i de tidlige stadier af cellulær kultur. Imidlertid plasmids let kan gå tabt som udvælgelses antibiotiske niveauer ændre sig i løbet af dyrkningsperioden. Dette kan føre til plasmid ustabilitet (dvs. tabet af en eller flere plasmider under dyrkning), hvilket ville begrænse produktionskapacitet. Problemet forværres, når inkompatible plasmider anvendes til at indføre et fuldstændigt heterologt gen klyngen. Dette er tilfældet for erythromycin A-forbindelse (fig. 5) og skulle rettes lige overproducere forbindelsen fra E. coli. Men for at påvise oprindelige produktion er sådanne konstruktionsfejl tolereres af hensyn til hurtigt om gennemførligheden af den heterologe fremgangsmåde.
- Klarlægge kulturer ved centrifugering ved 10.000 rpm i en Eppendorf mikrofuge. Supernatanten fjernes, og opbevar ved 4 ° C til analyse.
- I forbindelse med erythromycin A, manglende forbindelse produktion blev behandlet optagelse af GroES / EL chaperonin (hjælp pGro7til specifikt at tage manglende aktivitet af enzymer efter ekspression) og medtagelse af yderligere genkopier (for de gener der mistænkes for svag ekspression / aktivitet). Lignende strategier kan være nødvendig med andre heterologe naturlige produkter produktionsindsats.
3. Product Analysis
- For at bekræfte og kvantificere erythromycin A formation, injiceres kultursupernatanten på en LC-MS-system (figur 6). Kommercielt tilgængelig erythromycin A blev anvendt til at bekræfte produktionen og som en standard under kvantificering. For tilfælde uden kommercielt tilgængelige standarder, ville LC-MS-analyse kræve yderligere kemisk karakterisering ved NMR-og højopløsningsmassespektrometri.
- Sammenlign produktionen mellem de 3 kolonier / kulturer fra BAP1 transformation. Vælg den højeste producent og forberede en glycerol bestand fra kolonien kilde. Dette trin kan ske parallelt med produktionen kulturer protokoltjenesten2 ved hjælp af en lille del af kulturerne til fremstilling af glycerol lagre. Opbevares glycerolstamopløsning i en -80 ° C fryser.
- Brug bekræftet, højeste producerende celle lager, et separat kultur begynde og udtrække den endelige supernatant med 2x volumen ethylacetat. Anvende et vakuum fordampningssystem at tørre ekstrakten og resuspender i 100 ul methanol. Hvorefter ekstrakten til et sterilt filter disk (~ 1/4 inch diameter) og tillade skiven at tørre. Særskilt, kultur B. subtillis i LB væske natten. Der tilsættes 20 ul af B. subtilis kultur til 20 ml flydende LB-agar ved 45 ° C. Plate agaren og lad den størkne. Placer filterskiven på pladen og inkuber ved 37 ° C (figur 7). Alternativt kan ekstrakten sættes til flydende kulturer i en plade med 96 brønde for at kvantificere aktiviteten ved en pladelæser (figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det ønskede resultat af denne fremgangsmåde er fremstillingen af en fuldt bioaktive naturligt produkt fra E. coli heterologe vært. Dette er bedst repræsenteret ved de LC-MS resultater anvendes til at bekræfte og kvantificere produktion (fig. 6), og den antibakterielle bioassay anvendes til at bekræfte den endelige aktivitet (figur 7). I den samlede ordning af heterologt biosyntese, definerer dette resultat succes. Når udført, forskningsindsats og derefter henvende sig til optimering (både på cellulært og proces skalaer) og molekylær teknik. De endelige mål omfatter økonomiske produktionsprocesser til den oprindelige forbindelse og kontrol med det heterologe system, således at rationelle modifikationer af processen kan bringes til at frembringe varianter af den oprindelige forbindelse med mulighed for en forhøjet eller udvidet aktivitetsspektrum.
Manglende frembringe den ønskede forbindelse derefter udløser adskillige beredskabsplaner to vurdere, hvilken del af indflyvningen forbyder vellykket biosyntese. Mange af disse fejlfinding findes mekanismer bygget i den procedure, der er beskrevet ovenfor. Ifølge vores erfaring er det vigtigt, som et minimum, for at bekræfte vellykket genekspression (SDS-PAGE analyse af opløselige biosyntetiske enzymer) af den nyligt indførte genklyngen forud for forsøget på at vurdere biosyntesen af det dannede naturlige produkt. Efter ekspression, som angivet ovenfor, er anvendelsen af proteinfoldning chaperoner, forbedret genkopital og procestemperatur været effektive midler til at tillade eventuel biosyntese.
Fig. 1. En samlet afbildning af det heterologe naturprodukt biosyntetiske ordning byder på den erythromycin A forbindelsen. De eksperimentelle nødvendige skridt omfatter 1) design og overførsel af erythromycin genklyngen frabout S. erythraea til E. coli, 2) rekonstituering af biosyntese i E. coli, og 3) produkt analyse af erythromycin A.
Figur 2. A. erythromycin genklynge som organiseret i den native S. erythraea kromosom. B. Erythromycin A-biosyntese. Inden E. coli er SFP enzym, der kræves for posttranslationel modifikation af DEBS1, 2 og 3 polyketide synthase enzymer (hver> 300 kDa), hvilket er angivet ved forbindelsesarmen knyttet til hver ACP-domæne. De Debs enzymer udgør en α 2 β to γ 2-kompleks opdelt i modulenheder, der katalyserer de konsekutive kondensationer af én starter propionyl-CoA enhed og seks (2S)-methylmalonyl-CoA blødgøringsmidler enheder til dannelse af polyketid 6-deoxyerythronolide B (6dEB). KS-ketosynthase, AT-acyl transferase, ACP-acylbærerprotein, KR-ketoreductase (med den inaktive KR bemærkede i modul 3), DH-dehydratase, ER-enoyl reduktase; TE-thioesterase. En PrpE (propionyl-CoA syntetase) og PCC (propionyl-CoA carboxylase, som består af to proteinunderenheder) kræves for at omdanne exogen propionat til begyndelsespunktet substrater propionyl-CoA, og (2S)-methylmalonyl-CoA. Generne for SFP og PrpE tidligere blev konstrueret i BAP1 E. coli kromosom 19. Omdannelse af 6dEB molekyle til erythromycin opnås ved deoxysugar biosyntesen og fastgørelse, ekstra skrædderi, og selv-resistens-enzymer. Klik her for at se større figur .
Figur 3. A. Isolering af enkelte gener, der er nødvendige for erythromycin A-biosyntese (uden de tre Debs gener). Individuelle plasmid design herunder de PCR-oligonukleotidprimere, der anvendes til isolering eryCI, primer-restriktionssteder er angivet med fed og komplementære sekvens er blevet understreget. Også indbefattet er restriktionsanalyse af de resulterende pET21 og pET28 vektorer indeholdende individuelle gener og operoner. B. Jeg. Konsolidering af de biosyntetiske gener, der er nødvendige for polyketid skræddersy som operoner for introduktion til E. . coli. ii restriktionssted og andre ekspressionselementer involveret med operon konstruktion og udformning, X / S repræsenterer den kompatible-kohæsive ligering af Xba I og Spe I sites, som resulterer i en ny sekvens genkendt af enten restrictipå enzymet. Klik her for at se figur 3 .
Figur 4. A. SDS-PAGE analyse af de enkelte gener, vist i figur 3. Stjernerne betegner de gener udtrykkes med 5 'ledersekvenser følge af pET28 ekspressionsvektor. B. Fænotypisk vurdering af Erme (erythromycin A-resistens). Erythromycin A som fast medium til at teste E. coli stammer, der huser plasmider med eller uden ermE erythromycin A resistensgen. Cellevækst er reddet med med ermE udtryk.
Figur 5. A. Skematisk af den fulde erythromycin A pathway indført i E. coli, herunder et plasmid for GroEL / ES chaperonin (pGro7) og et plasmid indeholdende en ekstra kopi af Eryk. B. Transformation sammenligning mellem kemiske og elektro metoder under anvendelse af både blanding (i) og sekventiel (ii) indførelse af plasmider. C. Plasmid stabilitet transformeret stamme. Klik her for at se større figur .
Figur 6. En standard LC-MS spor af erythromycin A fremstillet af E. coli.
Figur 7. A. Fastfase bioassay af filterskiver indeholder i. Uddrag fra en uinducerede BAP1 E. coli negativ kontrol; ii kommercielt tilgængelig erythromycin A (positiv kontrol).. og iii erythromycin A udvundet fra en induceret BAP1 E. coli-systemet. Skiverne blev udpladet på et tæppe af B. subtilis bakterier og resulterende hæmningszoner indikerer antibiotisk aktivitet. B. Assay påvist i flydende fase under anvendelse af 96-brønds plade tidsforløb prøver. se større tal .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i heterolog biosyntesen er stødt på hver af de tre punkter i processen: 1) genetiske overførsel, 2) biosyntetiske rekonstitution og 3) produkt analyse. Et problem på noget tidspunkt vil afspore den ultimative målsætning om heterolog biosyntese. Måske er den mest udfordrende aspekt af processen etablerer rekonstitueret biosyntese, da dette absolut er nødvendigt, for vellykket analyse. Imidlertid rekonstitution afhænger af omhyggeligt design og overførsel af det genetiske materiale, der er ansvarlig for eventuel biosyntese. Ligeledes er etableret, kan følsomme analysemetoder (som LC-MS) detektere små titerniveauer der ellers kan fortolkes som manglende produktion. Det er kulminationen af disse situationer, der gør heterolog biosyntese udfordrende.
Med hensyn til erythromycin A eksempel blev bekræftet gensekvenser isoleret ved PCR individuelt testet for expression forud for konsolidering generne for koordineret ekspression og naturligt produkt dannelse. Under indledende forsøg på produkt-analysen blev mellemprodukter først identificeret, når et chaperonin (GroEL / ES) blev co-udtrykt med det krævede gen-klyngen. Slutproduktet blev kun fremstilles, når en yderligere kopi af genet er ansvarlig for det sidste trin i biosyntesen (Eryk) var inkluderet. Begge disse foranstaltninger gavn af den følsomme LC-MS anvendte analysemetode til indledningsvis at vurdere produktionen.
Nu, hvor produktionen er blevet bekræftet, at E. coli cellulære baggrund byder på utallige tekniske muligheder. Den første er at optimere produktionen af det native erythromycin Forbindelse. Dette ville tilbyde en alternativ produktion rute med potentielle besparelser i proces tid og omkostninger. Endvidere erythromycin A pathway kan manipuleres med henblik på at sprede produktdannelse. Nye analoger tilbydePotentialet af ny antibiotikum (eller anden terapeutisk) aktivitet. Disse samme muligheder findes til generelle anvendelser af heterolog biosyntese og give den primære motivation for den tilgang, yderligere understøttet af de udfordringer støder med mange oprindelige producerende organismer. Konstante applikationer og forbedringer af den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne artikel vil øge hyppigheden af fremtidige heterologe biosyntetiske succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne takker NIH (AI074224 og GM085323) og NSF (0.712.019 og 0.924.699) for finansiering til støtte for projekter vedrørende heterolog biosyntese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
References
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb). Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).
- Chen, Y., et al. Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).
- McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W.
- Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).
- Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale. Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).
- Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. Methods and options for the heterologous production of complex natural products. Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).
- Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 348, 176-178 (1990).
- Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 252, 675-679 (1991).
- Salah-Bey, K., et al. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea. Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).
- Summers, R. G., et al. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).
- Corre, C., Challis, G. L. New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining. Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).
- McAlpine, J. B. Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products. J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).
- Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).
- Oliynyk, M., et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).
- Wilkinson, B., Micklefield, J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).
- Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science. 284, 482-485 (1999).
- Quadri, L. E., et al. Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases. Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).
- Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291, 1790-1792 (2001).
- Lee, H. Y., Khosla, C. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli. PLoS Biol. 5, e45 (2007).
- Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).
- Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products. Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).
- Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering. Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).
- Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host. Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).
