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Artículo de método

Bilateral Común oclusión de la arteria carótida como un estímulo de preacondicionamiento adecuado para inducir la tolerancia isquémica precoz de isquemia cerebral focal

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DOI:

10.3791/4387

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9 de mayo de 2013

 ,  , 
1Department of Neurology, Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Germany

En este artículo

Resumen

Hay evidencia acumulada, que el precondicionamiento isquémico (PC) - un reto isquémico no perjudicial para el cerebro - confiere una protección transitoria a una posterior lesión isquémica perjudicial. Hemos establecido oclusión de la arteria carótida común bilateral (BCCAO) como un estímulo para inducir la tolerancia de preacondicionamiento isquémico temprano (IT) de la isquemia cerebral focal transitoria (inducida por la oclusión de la arteria cerebral media, OACM) en ratones C57BL6 / J.

Resumen

Hay evidencia acumulada, que el precondicionamiento isquémico - un reto isquémico no perjudicial para el cerebro - confiere una protección transitoria a una posterior lesión isquémica perjudicial. Hemos establecido oclusión de la arteria carótida común bilateral como un estímulo para inducir preacondicionamiento isquémico principios de la tolerancia a la isquemia cerebral focal transitoria en ratones C57BL6 / J. En este video, vamos a demostrar la metodología utilizada en este estudio.

Introducción

El ictus isquémico es una enfermedad con una alta mortalidad y una enorme carga socio-económica 1. A pesar de intensos esfuerzos científicos experimentales y clínicos de todo las últimas décadas, las opciones de tratamiento para los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico agudo sigue siendo muy limitada 2. En contraste con esto, el incremento en el porcentaje de personas de edad avanzada en los países desarrollados aumentará dramáticamente incidencias y prevalencias de los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico en las próximas décadas 3. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de nuevas estrategias de tratamiento en los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico.

Un enfoque consiste en lograr una mejor comprensión de los mecanismos de adaptación endógena del cerebro para hacer frente a un estímulo dañino. Esta neuroprotección derivado del cerebro también se conoce como el precondicionamiento isquémico (PC) o la tolerancia isquémica (TI) y describe un fenómeno, en el que un estímulo nocivo no perjudicial aplicada al cerebro, induce una resistencia transitoriacontra un posterior daño isquémico insulto 4. Se presenta en dos ventanas de tiempo diferentes: principios de IT, que se produce en pocos minutos a unas pocas horas después de la PC y lo retrasó, que necesita una latencia de un par de horas para producir 4.

Hasta ahora, la investigación sobre TIC en el cerebro se ha centrado en lo retrasó. Mucho menos se sabe sobre los mecanismos de principios de IT. El objetivo de este estudio es establecer oclusión de la arteria carótida común bilateral (BCCAO), que es un estímulo creado para inducir retraso de TI, como un estímulo PC adecuada para inducir a tiempo a la isquemia cerebral focal transitoria (inducida por la oclusión de la arteria cerebral media, MCAO) en ratones C57BL6 / J.

Durante los dos procedimientos quirúrgicos (BCCAO y MCAO), se realizó el seguimiento del flujo sanguíneo cerebral (CBF) por la flujometría láser Doppler (LDF).

BCCAO se realizó en ratones anestesiados y con respiración espontánea. Ambas arterias carótidas comunes (CCA) fueron expuestosy ocluido durante 60 segundos seguido de 5 min de reperfusión. Esta secuencia / reperfusión BCCAO se repitió dos veces. Después de la cirugía, los ratones se recuperaron rápidamente y no mostraron signos de deterioro funcional. Con el fin de descartar, que el protocolo BCCAO descrito anteriormente no dio lugar a la muerte celular retardada en el cerebro, se realizó un dUTP-biotina nick fin de etiquetado TdT-mediada (TUNEL) tinción de 72 horas después de BCCAO (o cirugía simulada) en un grupo separado.

MCAO es un modelo ampliamente establecido para la inducción de isquemia cerebral focal en los roedores 5-7. Los procedimientos quirúrgicos se llevaron a cabo usando procedimientos operativos normalizados (SOP) 8. Después de exponer CCA izquierda, un monofilamento de silicio-cubierto se introdujo en el CCA distal, avanzado a través de la arteria carótida interna (ACI) en el círculo de Willis hasta que la arteria cerebral anterior (ACA) y de ese modo, el origen de la arteria cerebral media ( MCA) fue ocluida por un período de tiempo definido. En este estudio, seutilizado 45 min de MCAO, que por lo general resulta en una lesión isquémica en el territorio de la ACM que implica áreas del cerebro del cuerpo estriado y corticales.

En nuestro estudio, analizamos el perfil temporal de los principios de IT utilizando BCCAO como estímulo PC. Nuestros datos indican que el tiempo de retardo óptimo entre BCCAO y MCAO para inducir temprana es de 30 min.

En este video, vamos a dar una demostración de ambos procedimientos quirúrgicos, es decir BCCAO y MCAO.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este artículo se realizaron de acuerdo con las directrices y normas del Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín, Alemania.

Procedimientos prequirúrgicos

1. Preparación de monofilamentos

  1. Para la preparación de filamentos intraluminales, se utilizaron 8-0 suturas de monofilamento de nylon y se cortaron a una longitud de 13 mm cada uno.
  2. Para el recubrimiento de los monofilamentos, Xantopren M mucosa, (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Alemania) se utilizó activa mediante la adición de una gota de solución de activador (Activador, más universal, Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Alemania).
  3. El monofilamento se retiró lentamente a través de la silicona hasta que fue completamente cubierto con ella. Al hacerlo, el monofilamento estaría cubierto uniformemente con silicona. Evite esperar mucho tiempo ya que el material de revestimiento activo se convertirá en firme y seca rápidamente.
  4. Antes de la silicona empieza a solidificar, Se recomienda quitarse de silicona excesiva del filamento tirando de él sobre una hoja de papel. De esta manera, la capa de silicona se puede diluir a un espesor aproximado de 200 micras.
  5. La base del monofilamento de silicona cubierta estaba atrapado en plastilina con el fin de dejar que se seque durante la noche.

Comentario: Idealmente, sólo esterilizados o desinfectados por lo menos monofilamentos deben utilizarse para asegurar la esterilidad en el sitio quirúrgico. En la práctica, la esterilización o desinfección de los monofilamentos hechos a mano es muy difícil debido a la calidad de los monofilamentos puede empeorar 9. Por lo tanto, podría ser preferible utilizar monofilamentos estériles disponibles comercialmente en su lugar.

2. Preparación de los instrumentos quirúrgicos y de los animales

  1. Todos los instrumentos quirúrgicos se mantuvieron en alcohol etílico 70%. Además, antes de cada nuevo procedimiento quirúrgico, todos los instrumentos quirúrgicos se limpiaron cuidadosamente unand desinfectarse utilizando alcohol etílico al 70%.
  2. El área quirúrgica se desinfectó a fondo usando alcohol etílico 70% en todos los animales antes de la transección. Los sitios desinfectados se dejaron secar completamente antes de realizar las incisiones. Recorte adicional de la piel no se realizó ya que esto puede causar microabrasiones y la posterior inflamación de la piel 9.

Los procedimientos quirúrgicos

3. El posicionamiento de la sonda LDF LDF y Monitoreo

  1. Para la inducción de la anestesia, los ratones fueron expuestos a una mezcla gaseosa que consiste en 30% de oxígeno, 70% de N 2 O y 2,5% de isoflurano usando un vaporizador. Para el mantenimiento de la anestesia, la concentración de isoflurano se redujo a 1,5%. Los ratones se respiraban espontáneamente a través de la máscara de respiración durante todo el procedimiento quirúrgico.
  2. Una sonda de temperatura rectal se insertó y los ratones se fija al marco estereotáctico la exposición de la cabeza parietal. Durante la cirugía, los ratones estaban descansando en uncontrolado por termostato almohadilla térmica, garantizando una temperatura interna constante de 37,0 ± 0,5 ° C. Una incisión de línea media sagital (~ 1 cm de longitud) se realizó para exponer el cráneo parietal.
  3. El lado izquierdo del cráneo se diseccionó cuidadosamente y una sonda de fibra óptica se fija directamente en el cráneo 2 mm caudal y 5 mm lateral desde el bregma usando pegamento instantáneo. Después, bordes de la herida fueron cuidadosamente adaptadas para evitar la hipotermia cerebral, así como las infecciones.
  4. El ratón se dio la vuelta para exponer el lado ventral del cuello. La sonda de fibra óptica se conecta al dispositivo LDF (Periflux System 5000, Perimed, Järfälla, Suecia) a través de la conexión del adaptador de sonda (Master Sonda 418-1, Perimed; Järfälla, Suecia).

Comentario: Al girar el ratón, la sonda de fibra óptica debe ser doblado con cuidado para evitar que se rompa el cráneo.

  1. El dispositivo LDF se conectó a un ordenador portátil comordenador. Grabación continua de los valores LDF se inició con PeriSoft para Windows (versión 2.50, Järfälla, Suecia). Figura 1 demuestra el curso medio CBF obtenida de diez grabaciones LDF durante BCCAO y reperfusión.

4. Bilateral Común oclusión de la arteria carótida

  1. La anestesia se mantuvo como se describe en 3.1. Ratón se colocó en su espalda. La cola y las patas del animal se fijan a la almohadilla térmica con cinta adhesiva. Se realizó una incisión en la línea media ventral sagital (~ 1 cm de longitud).
  2. Ambas glándulas salival fueron cuidadosamente separados y se movilizaron para visualizar el subyacente del CCA.
  3. Tanto la CCA fueron separados de cuidado de los respectivos nervios vagos y venas acompañantes sin dañar estas estructuras. Las manipulaciones de los nervios vagales pueden conducir a la disfunción transitoria o permanente del sistema nervioso parasimpático, que tiene el potencial para la aparición de arr cardiaca significativahythmia o paro cardíaco, incluso irreversible. Por lo tanto, es crucial para evitar cualquier manipulación de los nervios vagales. Un 5-0 lazo de sutura de seda floja se hizo alrededor de cada CCA.
  4. Un pequeño tubo de silicona (diámetro 2 mm) se insertó en entre el CCA y las suturas de seda en cada lado. Este tubo se utiliza como un entablillado de la CCA de con el fin de evitar daños de las paredes arteriales cuando se aprietan las suturas (Figura 4).
  5. Tanto CCA del fueron ocluidas durante un minuto apretando las suturas de seda. Sólo los ratones, en el que la señal de LDF se redujo a <10% de la señal de línea de base se incluyeron en el estudio. Después de la reapertura de dos de CCA, se inició un período de reperfusión Cinco minutos. Por LDF se aseguró una reperfusión completa. Se excluyeron los animales con reperfusión incompleta (es decir, la recuperación <90% de la CBF en comparación con el valor basal CBF). La secuencia de un minuto de BCCAO y cinco minutos de la reperfusión se repitió dos veces para un total BCCAO DURATIen de 3 min. Figura 1 muestra el curso CBF media obtenida a partir de diez grabaciones LDF durante BCCAO y reperfusión. Durante el procedimiento, se recomienda mantener el cuello herida húmeda con solución salina normal.
  6. Después de la última reperfusión, se eliminaron todos los tubos y suturas, así como la sonda de fibra óptica pegado al cráneo, las heridas se suturaron y pomada de lidocaína (Xylocain 2%; AstraZeneca GmbH, Wedel, Alemania) se aplicó varias veces para las heridas, según sea necesario para los manejo analgésico.
  7. Los animales fueron trasladados a un pre-calentado (30 ° C) Caja de recuperación (MediHEAT. PecoServives Ltd. Brough, Cumbria, Reino Unido) hasta haber recuperado la conciencia completa. A partir de entonces, los ratones fueron devueltos a sus jaulas de los animales.

5. Medio oclusión de la arteria cerebral

  1. Los ratones se re-anestesiado, se insertó una sonda de temperatura rectal y los ratones fueron colocados en una almohadilla de calefacción para exponer el lado ventral del cuello. Después, were fijado como se describe en la sección BCCAO.
  2. Una ligadura permanente utilizando una sutura de seda 7-0 larga se realiza alrededor de la izquierda proximal CCA y el hilo se tira suavemente caudalmente con una abrazadera de mosquitos (Figura 4).
  3. Otra ligadura permanente se hizo alrededor de la arteria carótida externa izquierda (CEPA) y el hilo se estira hacia el lado derecho del animal (Figura 4).
  4. El tejido conectivo que rodea el ICA izquierda se movilizó con cuidado y el nervio hipogloso se levantó con cuidado para obtener una buena visión general del curso distal del ICA. Las curvas ICA izquierda a la izquierda, mientras que la arteria pterigopalatina (PPA) sigue el curso de la ACI proximal a la derecha (figura 4).

Comentario: Hay otra arteria para ser identificado, que gira a la derecha en dirección caudal. Esta es la arteria occipital, que se origina de forma variable ya sea desde la bifurcación de la ACC o de la proximal parte del Tribunal de Cuentas (Figura 4).

  1. Un lazo de sutura floja se hace alrededor de la ACI proximal mediante un hilo de seda 5-0.
  2. Usando una pequeña pinza microvascular, la ACI se ocluyó temporalmente distalmente al bucle de sutura suelta 5-0 (Figura 4).
  3. Una pequeña incisión fue hecha en la parte distal del CCA justo antes de la bifurcación de la ACC utilizando tijeras microvasculares (Figura 4).
  4. Un preseleccionado monofilamento de silicona cubierta de se introdujo en el CCA a través de la pequeña incisión y se introduce en el ICA hasta que se detuvo en la pinza microvascular (Figura 4).
  5. El microclamp se retiró cuidadosamente de la ACI, mientras que el monofilamento se hace avanzar más profundamente en el ICA hasta que se detuvo (Figura 4). Comentario: En este punto, girar las pinzas en la mano izquierda de modo que usted no la mantiene como una pluma. Esto ayuda a tomar el filamento con las pinzas con mayor facilidad.La vascular clamp-aplicador se celebre en la mano derecha. Puede que sea necesario a casi apriete la flojo 5-0 sutura alrededor del ICA con el fin de prevenir el sangrado de la incisión lateral.
  6. La ubicación exacta de la punta del monofilamento se identificó para comprobar si se ha avanzado en el ICA y no en el PPA. Si la punta del monofilamento se introdujo en el PPA proximal, el filamento se tiró suavemente de nuevo justo antes de la bifurcación ACI / PPA. Se intentó hacer avanzar el monofilamento en el ICA de nuevo, mientras que tirando suavemente de la ACI proximal un poco hacia el lado derecho. De esta manera, el curso natural de la ACI distal se simuló por lo que es más fácil acceder a la ICA.
  7. Después el monofilamento se hace avanzar en el ICA casi por completo, la suelta 5-0 lazo de sutura alrededor de la ACI proximal se apretó con el fin de mantener el filamento en su lugar. Después, todos los hilos de seda se acortaron y la herida se suturó la piel.
  8. La pérdida de líquidos durante la cirugía se replenished mediante la inyección de 1,0 ml de solución salina normal ip Después, el ratón fue transferido a la caja de recuperación precalentado hasta que se recuperó el conocimiento completo.
  9. Para la reperfusión, los ratones fueron anestesiados y re-monofilamento se retiró después de aflojar con cuidado el hilo de sutura de seda 5-0 alrededor del ICA proximal. Posteriormente, el 5-0 de sutura se apretó de nuevo con cuidado con el fin de prevenir el sangrado.
  10. Después de la confirmación de la hemostasia completa, la herida del cuello se suturó.
  11. La lidocaína ungüento se aplicó varias veces localmente a la piel según sea necesario para aliviar el dolor y el ratón fue transferido a la pre-calentado (30 ° C) caja de recuperación hasta que se recuperó el conocimiento completo.
  12. Como se observó una primera sugerencia para un procedimiento MCAO éxito, una de las agujas del reloj girando el animal. La gravedad del déficit funcional se cuantificó mediante la puntuación de Bederson modificado para los ratones 10. De acuerdo con esta puntuación Bederson modificado, los resultados neurológicos quevolver clasificado de la siguiente manera: 0 (función motora normal), 1 (flexión de tronco y extremidad anterior contralateral cuando el ratón se levantó por la cola), 2 (en circuito en el lado contralateral cuando el ratón se llevó a cabo por la cola en una superficie plana, pero lo normal postura en reposo), 3 (que se inclina hacia el lado contralateral en reposo), y 4 (sin actividad motora espontánea o muerto).

6. BCCAO Cirugía Sham

Para los procedimientos de BCCAO simuladas, los ratones fueron anestesiados durante la duración de un procedimiento real de BCCAO PC, las glándulas salivación se movilizaron y el CCA del fueron expuestos. Es crucial que las manipulaciones directas a las arterias carótidas o de los nervios vagales se evitan durante el procedimiento simulado. Las manipulaciones de la CCA pueden dañar su capa endotelial, lo cual puede resultar en una liberación de compuestos vasoactivos de endotelio o inducir trombosis local dentro de la luz arterial. Como consecuencia, los eventos tromboembólicos pueden ocurrir después de una cirugía simulada. Esto sería un importante factor de confusión de thprocedimiento e. Por otro lado, las manipulaciones de los nervios vagales pueden conducir a la disfunción transitoria o permanente del sistema nervioso parasimpático, que tiene el potencial para la aparición de la arritmia cardiaca significativa o paro cardíaco, incluso irreversibles. Por lo tanto, es crucial para evitar cualquier manipulación de los nervios vagales durante BCCAO.

Procedimientos posteriores a la cirugía

7. Infarto mediciones de volumen

Para la evaluación de los tamaños de infarto, los ratones sobrevivieron durante 72 horas después de MCAO. Después los animales se anestesiaron profundamente, se retiraron los cerebros, se congelaron en metilbutan, seccionadas y teñidas con hematoxilina (utilizando el protocolo de Papanicolau) para las mediciones de volumen del infarto. Secciones de cerebro se recogieron a 600 micras de intervalos y los volúmenes de infarto se determinó usando un analizador de imágenes (MCID núcleo 7.0 Rev.2.0, GE Healthcare Cataratas Inc) y corregido para el edema de acuerdo con el método de Lin et al. 7,11 .

8. Criterios de inclusión

Se incluyeron sólo los animales que tenían una reducción CBF LDF-medido en más de un 90% durante cada uno de los tres episodios BCCAO. Idealmente, el monitoreo LDF se debe realizar en ambos hemisferios cerebrales durante BCCAO. Para practicabilidad, se realizó el seguimiento LDF sólo en los hemisferios izquierdo, que serán sometidos a MCAO más adelante. Este enfoque se ha descrito antes 6,12. Reperfusión después de cada episodio BCCAO debía ser completa (es decir, volver a los valores de referencia). En aras de la reducción del tiempo de duración de los ratones se mantuvieron bajo anestesia, no controlamos CBF durante la cirugía MCAO. En un estudio piloto con un grupo separado de animales sin embargo, que supervisó CBF por LDF durante la cirugía MCAO. En este grupo de ratones, se midió consistentemente una reducción en el FSC en un 90% en comparación con el valor basal antes de la oclusión CCA. Además, después de la eliminación de monofilamentos CBF recuperado a> 90% de la respectivalos valores basales después de la oclusión de CCA. Estos criterios LDF se establecen en la literatura y el resultado en volúmenes de infarto consistentes 7. Sólo se incluyeron los animales que tenían una puntuación Bederson de al menos de 1 después de la recuperación de la anestesia después de MCAO. Por otra parte, sólo los animales que sobrevivieron durante 72 horas después de la MCAO y que no mostraron signos de hemorragia intracraneal se incluyeron en el estudio.

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Resultados

Nuestro protocolo BCCAO resultó en reducciones CBF inmediatos y profundos (> 90%) cuando ambos estaban ocluidos de CCA (Figura 1). Reapertura de la CCA de Led para completar la reperfusión como la supervisión de LDF (Figura 1). Después de PC, los animales no mostraron signos de discapacidad funcional. Por otra parte, no hubo mortalidad. La tinción de TUNEL realizó 72 h después de BCCAO en un grupo separado de animales no mostraron signos de muerte celular retardada en el cerebro desp...

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Discusión

En nuestro estudio, hemos demostrado que las tres secuencias de BCCAO, con una duración de un minuto y seguida de reperfusión durante cinco minutos, son un estímulo suficiente para inducir PC isquémico temprano IT.

Por otra parte, hemos demostrado que el protocolo de preacondicionamiento utilizado es un procedimiento invasivo seguro y de menor importancia sin la morbilidad postoperatoria digno de mención, sin signos de apoptosis en el cerebro y sin mortalidad. Varios protocolos de preacondic...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio quirúrgico binocularZeissStemi 2000 C
Fuente de luz para microscopioZeissSteREO CL 1500 ECO
Almohadilla térmica con sonda rectalFST21061-10
Marco estereotáxicoDavid KopfModelo 930
TijerasFST91460-11
Pinzas Dumont n.º 5FST11251-10
Pinzas Dumont n.º 7FST11271-30
Pinza microvascularFST00398-02
Aparato aplicador de pinzasFST00072-14
Tijeras de resorteFST15372-62
PortaagujasFST12010-14
AgujasFeuerstein, SupramaBER 562-20
Sutura de seda 5-0Feuerstein, Suprama
Sutura de seda 7-0Feuerstein, Suprama
Sutura de seda 8-0Feuerstein, Suprama

Referencias

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