RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

Summary

Este protocolo presenta un procedimiento completo y detallado de aplicar RNA-seq, una potente tecnología de próxima generación de secuenciación de ADN, a transcriptomes perfil en humanos células endoteliales microvasculares pulmonares con o sin tratamiento con trombina. Este protocolo es generalizable a diversas células o tejidos afectados por diferentes reactivos o estados de enfermedad.

Abstract

La caracterización de la expresión génica en las células a través de la medición de los niveles de mRNA es una herramienta útil en la determinación de cómo la maquinaria transcripcional de la célula se ve afectado por señales externas (por ejemplo, tratamiento de drogas), o cómo difieren entre las células un estado saludable y un estado de enfermedad. Con el advenimiento y refinamiento continuo de la tecnología de ADN secuenciación de próxima generación, ARN-secuenciación (RNA-seq) se ha convertido en un método cada vez más popular de análisis del transcriptoma para catalogar todas las especies de transcripciones, para determinar la estructura de la transcripción de todos los genes expresados ​​y cuantificar los cambios en los niveles de expresión de la serie total de transcripciones en un ^1,2 dado célula, tejido u organismo. RNA-seq está reemplazando gradualmente microarrays de ADN como un método preferido para el análisis de transcriptoma porque tiene las ventajas de un perfil de un transcriptoma completa, proporcionando un dato de tipo digital (número de copias de cualquier transcripción) y no depender de cualquier secuencial genómico conocidoce ^3.

A continuación, presentamos un protocolo completo y detallado para aplicar RNA-seq para transcriptomes perfil pulmonares humanas en células endoteliales microvasculares con o sin tratamiento con trombina. Este protocolo se basa en el estudio recientemente publicado titulado "RNA-seq revela Transcriptome novela de genes y sus isoformas en humanos células endoteliales microvasculares pulmonares tratadas con trombina," ⁴ en el que realizó con éxito el primer análisis completo de transcriptoma humano pulmonar de células endoteliales microvasculares tratados con trombina utilizando ARN-seq. Cedió recursos sin precedentes para nuevos experimentos para comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacen a la trombina mediada por disfunción endotelial en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias, cáncer, diabetes y enfermedad cardiaca coronaria, y proporciona nuevas pistas para posibles dianas terapéuticas para estas enfermedades.

El texto descriptivo de este protocolose divide en cuatro partes. La primera parte se describe el tratamiento de humanos pulmonar de células endoteliales microvasculares con trombina y el aislamiento de ARN, análisis de la calidad y la cuantificación. La segunda parte describe la construcción de bibliotecas y la secuenciación. La tercera parte se describe el análisis de datos. La cuarta describe un ensayo de validación de RT-PCR. Los resultados representativos de varios pasos claves se muestran. Consejos útiles y precauciones para impulsar el éxito en los pasos claves se proporcionan en la sección de debate. Aunque este protocolo utiliza humanos pulmonar de células endoteliales microvasculares tratados con trombina, que se pueden generalizar a transcriptomes perfil tanto en células de mamíferos y no mamíferos y en los tejidos tratados con diferentes estímulos o inhibidores, o para comparar transcriptomes en células o tejidos entre un estado saludable y un estado de enfermedad.

Protocol

Un diagrama de flujo delinear este protocolo se muestra en la figura 1.

1. El tratamiento de células con trombina, Aislamiento de ARN, Evaluación de la Calidad y cuantificación de ARN

1. Cultivar células endoteliales microvasculares de pulmón (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluencia en placas de 6 pocillos en medio EGM-2 con 5% de SFB, factores de crecimiento y antibióticos (Lonza, cat # CC-3202).
2. Cambiar el medio a los medios de inanición (0% FBS) 30 min antes del tratamiento con trombina.
3. Se tratan las células con 0,05 U / ml de trombina o dejar sin tratar como control durante 6 horas a 37 ° C....

Results

Para el Paso 1: El 28s: relación de 18 años se utiliza tradicionalmente como un indicador de la degradación del ARN. Idealmente, el pico 28s debería tener aproximadamente dos veces el área de la banda de 18 años (una proporción de 2), sin embargo esta relación ideal no se ve a menudo en la práctica. Además, 28s: 18s coeficientes obtenidos a partir de métodos espectrofotométricos se puede subestimar la cantidad de degradación del ARN. Para cuantificar con mayor precisión la degradación, y por lo tanto la.......

Discussion

Los pasos clave

Manejo de ARN: RNasas se degradará hasta la más alta calidad del ARN, por lo tanto se debe tener cuidado durante el aislamiento, el almacenamiento y el uso de RNA ^10. Los guantes se usan siempre para prevenir la contaminación por RNasas se encuentran en manos humanas. Los guantes deben ser cambiados con frecuencia, especialmente después de tocar la piel, pomos de las puertas u otras superficies comunes. Un conjunto de las pipetas deben estar dedicados.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Los reactivos o equipos	Empresa	El número de catálogo	Comentarios
Las células pulmonares humanas endoteliales microvasculares	Lonza	CC-2815
Lonza, Kit de bala	Lonza	CC-3202	Contiene EGM-2, FBS, factores de crecimiento y antibióticos
La trombina	Sigma	T4393
Ambion mir Vana Kit	Life Technologies	AM 1560
RNasa-Zap	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens ARN	Bio-Rad	700-7103
TruSeq ARN PreparaciónEquipo	Illumina	FC-122-1001
AMPureXP Beads	Beckman Coulter	A63881
Superíndice II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Experion ADN 1K	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SyberGreen	Qiagen	204163
PE Generación Cluster Kit	Illumina	PE-401-3001
PhiX Kit de control	Illumina	FC110-301
200 Ciclo SBS Kit	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ *	Illumina	SY-103-2001
CBOT	Illumina	SY-301-2002
máquina qPCR - Viia7	Life Technologies	Modelo # VIIA7 / Equipo # 10631261	O el equivalente
Experion Sistema	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer es un sistema alternativo
Espectrofotómetro	Bio-Tek	Espectrofotómetro para Microplacas Epoch	O el equivalente
Centrífuga - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	O el equivalente
Soporte magnético	Life Technologies	AM10027
De 96 pocillos del termociclador	Laboratorio General de Proveedor
			Tabla 3. Lista de los reactivos clave y E Majorquipment. * En el video, en lugar de HiSeq1000 HiScanSQ se demostró.