Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Resumen

Un método cuantitativo para el análisis de sincronización cromosoma replicación se describe. El método utiliza la incorporación de BrdU en combinación con fluorescente In situ Hibridación (FISH) para evaluar el tiempo de replicación de los cromosomas de mamíferos. Esta técnica permite la comparación directa de los cromosomas reordenados y reordenados ONU-dentro de la misma célula.

Resumen

La replicación del ADN de mamíferos se inicia en varios sitios a lo largo de los cromosomas en diferentes momentos durante la fase S, siguiendo un programa de repetición temporal. La especificación de la sincronización de replicación se cree que es un proceso dinámico regulada por señales específicas de tejido y de desarrollo que son sensibles a las modificaciones epigenéticas. Sin embargo, los mecanismos que regulan dónde y cuándo se inicia la replicación del ADN a lo largo de los cromosomas sigue siendo poco conocida. Los cromosomas homólogos suele replicar de forma sincrónica, sin embargo, hay excepciones notables a esta regla. Por ejemplo, en células de mamífero hembra uno de los dos cromosomas X se convierte tarde replicación a través de un proceso conocido como inactivación X ^1. Junto con este retraso en el tiempo de replicación, estimado en 2-3 horas, la mayoría de los genes se transcriptionally silenciados en un cromosoma X. Además, un discreto de acción en cis locus, conocido como el centro de la inactivación X, regula este proceso de inactivación X, incluyendo the inducción de la replicación de temporización retardada en el cromosoma X inactivo completo. Además, ciertos reordenamientos cromosómicos que se encuentran en las células cancerosas y en células expuestas a la radiación ionizante mostrar un retraso significativo en el tiempo de replicación de> 3 horas que afecta a todo el cromosoma ^2,3. Trabajos recientes de nuestro laboratorio indican que la interrupción de discreta actuación cis resultado autosómica loci en un fenotipo de replicación muy tarde que afecta al ⁴ cromosoma entero. Estudios adicionales de ingeniería de cromosoma 'indican que los reordenamientos cromosómicos que afectan a los cromosomas diferente resultado, muchos en este momento la replicación anormal fenotipo, lo que sugiere que todos los cromosomas de mamíferos contienen discretas que actúan en cis loci que controlan la sincronización correcta replicación de los cromosomas ^5.

Aquí, se presenta un método para el análisis cuantitativo de la replicación del cromosoma de temporización en combinación con hibridación in situ fluorescente. Estamétodo permite una comparación directa de la replicación de temporización entre cromosomas homólogos en la misma célula, y se adaptó a partir de ^6. Además, este método permite la identificación inequívoca de los reordenamientos cromosómicos que se correlacionan con cambios en el plazo que afectan a la replicación de todo el cromosoma. Este método tiene ventajas sobre el reciente desarrollo de alto rendimiento micro-array o secuenciación protocolos que no pueden distinguir entre homólogos alelos presentes en reordenar y reorganizar un-cromosomas. Además, debido a que el método descrito aquí evalúa las células individuales, se puede detectar cambios en el tiempo de replicación en el cromosoma reordenamientos cromosómicos que están presentes en sólo una fracción de las células en una población.

Protocolo

1. BrdU incorporación (denominación de los terminales)

1. Células de la placa a aproximadamente 70% de confluencia en un cultivo de tejido de 150 mm plato 24 horas antes de la adición de BrdU.
2. Sustitución de los medios por nuevos medios completos que contienen 20 mg / ml de BrdU (Sigma) en puntos de tiempo apropiados antes de la cosecha. La longitud de tiempo de las células se cultivan en medios con BrdU variará con el tipo celular y la especie, típicamente la fase G2 dura entre 2 y 5 horas (Figura 1).

2. Cromosoma cosecha de cultivos monocapa de células

1. Eliminar los medios de cultivo de....

Resultados

Un ejemplo del análisis de tiempo de replicación para el cromosoma 6 humano se muestra en la Figura 2. Las células que contienen una deleción del gen ASAR6 ^4, que se encuentra en 6q16.1, fueron expuestos a BrdU durante 5 h, se recogieron las células mitóticas y para peces con una sonda de cromosoma pintura 6 (Vysis) y para la incorporación de BrdU. Observe que no hay una diferencia significativa en el patrón de BrdU de bandas entre los dos 6, que es coherente con un retraso en el tiempo de re.......

Discusión

La preparación de extensiones de cromosomas es un paso crítico para el éxito de la replicación de temporización ensayo descrito aquí. La inclusión de una etapa de pretratamiento antes de la colcemid tratamiento hipotónico puede ayudar en la frecuencia y la propagación de las células mitóticas. Nos típicamente exponer las células a colcemdi de 1-3 h antes de la cosecha, y el uso colcemid a una concentración final de 10 ug / ml. Sin embargo, la inclusión de una etapa de pretratamiento colcemid puede alterar la longitud de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre de Reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 g / l
Nick Translation Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Orange dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Varía
LSI / WCP tampón de hibridación	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP tampón de hibridación	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Cromosoma paints	Metasistemas Grupo	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 microscopio de fluorescencia	Olimpo	BX61TRF-1-5
Imágenes de microscopio software del sistema	Applied Imaging	Cytovision 3.93.1
Cámara Digital	Olimpo	UCMAD3
			En las recetas de hibridación in situ Soluciones Formamida 70% Formamide/2x SSC 35 ml * La formamida (Sigma) 10 ml de 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH a 7,0 con HCl (Sigma) * Es importante utilizar formamida que se ha almacenado a -20 ° C. El almacenamiento prolongado temperatura ambiente va a generar ácido fórmico y el pH wenfermedad sea demasiado baja. 50% Formamide/2x SSC 25 ml de formamida (Sigma) 10 ml de 10x SSC 15 ml dH 2 O pH a 7,0 con HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g de NaCl (Sigma) 358 g Citrato de Na (Sigma) dH 2 O al volumen PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Hacer una solución 0,1 M de cada uno de fosfato de sodio (Filtro de esterilizar y almacenar en alícuotas de 500 ml). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O al volumen 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L 14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O al volumen. PN: Ajustar el pH de 0,1 M Na 2 HP0 4 a pH 8,0 con 0,1 M NaH 2 P0 4. Esterilizar por filtración y se añade 1 ml de NP-40. PNM 50 ml 1,25 g leche descremada seca (Sigma) 25 ml tampón de PN (receta anterior) Mezclar durante 15-20 min con agitación constante. Girar 2 veces a 400 xg durante 10 min. Utilice sobrenadante, y asegúrese de no molestar a las proteínas precipitadas leche.