Artículo de método

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente

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DOI:

10.3791/4400

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10 de diciembre de 2012

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

En este artículo

Resumen

Un método cuantitativo para el análisis de sincronización cromosoma replicación se describe. El método utiliza la incorporación de BrdU en combinación con fluorescente In situ Hibridación (FISH) para evaluar el tiempo de replicación de los cromosomas de mamíferos. Esta técnica permite la comparación directa de los cromosomas reordenados y reordenados ONU-dentro de la misma célula.

Resumen

La replicación del ADN de mamíferos se inicia en varios sitios a lo largo de los cromosomas en diferentes momentos durante la fase S, siguiendo un programa de repetición temporal. La especificación de la sincronización de replicación se cree que es un proceso dinámico regulada por señales específicas de tejido y de desarrollo que son sensibles a las modificaciones epigenéticas. Sin embargo, los mecanismos que regulan dónde y cuándo se inicia la replicación del ADN a lo largo de los cromosomas sigue siendo poco conocida. Los cromosomas homólogos suele replicar de forma sincrónica, sin embargo, hay excepciones notables a esta regla. Por ejemplo, en células de mamífero hembra uno de los dos cromosomas X se convierte tarde replicación a través de un proceso conocido como inactivación X 1. Junto con este retraso en el tiempo de replicación, estimado en 2-3 horas, la mayoría de los genes se transcriptionally silenciados en un cromosoma X. Además, un discreto de acción en cis locus, conocido como el centro de la inactivación X, regula este proceso de inactivación X, incluyendo the inducción de la replicación de temporización retardada en el cromosoma X inactivo completo. Además, ciertos reordenamientos cromosómicos que se encuentran en las células cancerosas y en células expuestas a la radiación ionizante mostrar un retraso significativo en el tiempo de replicación de> 3 horas que afecta a todo el cromosoma 2,3. Trabajos recientes de nuestro laboratorio indican que la interrupción de discreta actuación cis resultado autosómica loci en un fenotipo de replicación muy tarde que afecta al 4 cromosoma entero. Estudios adicionales de ingeniería de cromosoma 'indican que los reordenamientos cromosómicos que afectan a los cromosomas diferente resultado, muchos en este momento la replicación anormal fenotipo, lo que sugiere que todos los cromosomas de mamíferos contienen discretas que actúan en cis loci que controlan la sincronización correcta replicación de los cromosomas 5.

Aquí, se presenta un método para el análisis cuantitativo de la replicación del cromosoma de temporización en combinación con hibridación in situ fluorescente. Estamétodo permite una comparación directa de la replicación de temporización entre cromosomas homólogos en la misma célula, y se adaptó a partir de 6. Además, este método permite la identificación inequívoca de los reordenamientos cromosómicos que se correlacionan con cambios en el plazo que afectan a la replicación de todo el cromosoma. Este método tiene ventajas sobre el reciente desarrollo de alto rendimiento micro-array o secuenciación protocolos que no pueden distinguir entre homólogos alelos presentes en reordenar y reorganizar un-cromosomas. Además, debido a que el método descrito aquí evalúa las células individuales, se puede detectar cambios en el tiempo de replicación en el cromosoma reordenamientos cromosómicos que están presentes en sólo una fracción de las células en una población.

Protocolo

1. BrdU incorporación (denominación de los terminales)

  1. Células de la placa a aproximadamente 70% de confluencia en un cultivo de tejido de 150 mm plato 24 horas antes de la adición de BrdU.
  2. Sustitución de los medios por nuevos medios completos que contienen 20 mg / ml de BrdU (Sigma) en puntos de tiempo apropiados antes de la cosecha. La longitud de tiempo de las células se cultivan en medios con BrdU variará con el tipo celular y la especie, típicamente la fase G2 dura entre 2 y 5 horas (Figura 1).

2. Cromosoma cosecha de cultivos monocapa de células

  1. Eliminar los medios de cultivo de la placa y recoger 10 ml en un tubo de 15 ml de centrífuga cónico. Deseche los medios restantes.
  2. Enjuagar las células una vez con 10 ml versine [o HBSS (Sigma)].
  3. Añadir 5 ml de tripsina 0,25% en versine (o HBSS) a la placa. Incubar a temperatura ambiente hasta que las células se separan de la placa.
  4. Añadir suspensión de células se tripsinizaron al tubo que contiene los 10 ml de medios de paso 2,1.
  5. Centrifugar a 400 xg durante 10 min para sedimentar las células. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 ml de medio más el sedimento celular.
  6. Resuspender las células a fondo por pipeteo con una pipeta Pasteur.
  7. Añadir 3 gotas de solución hipotónica (0,075 M KCl (Sigma) se calentó a 37 ° C) y mezclar la suspensión de células con una pipeta Pasteur. Añadir 0,5 ml de solución hipotónica y se mezcla de nuevo con una pipeta Pasteur. Llevar a un volumen de solución hipotónica a 5 ml y mezclar de nuevo. Incubar a 37 ° C durante 20-45 min, dependiendo del tipo de célula.
  8. Centrifugar a 400 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 ml de medio más el sedimento celular.
  9. Resuspender el pellet de células agitando suavemente el tubo. Las células osmóticamente hinchadas será frágil en este punto, por lo que se debe tener cuidado de no perturbar las membranas citoplasmáticas.
  10. Añadir 3 gotas de fijador (1:3 ácido acético glacial: metanol) Carnoy y mezcle suavemente con una pipeta Pasteur pipeteee. Añadir 0,5 ml de fijador y mezclar pipeteando suavemente con una pipeta Pasteur. Llevar a un volumen de fijador a 5 ml y mezclar de nuevo pipeteando suavemente con una pipeta Pasteur. Las células fijadas se pueden almacenar en la oscuridad a -20 ° C durante varios meses.
  11. Centrifugar y aspirar como en el paso 2,8.
  12. Resuspender el sedimento celular en fijador fresco; estimar el volumen de la pastilla y añadir 10 veces el volumen de ~ fijador de Carnoy.
  13. Añadir la suspensión celular gota a gota en portaobjetos de microscopio húmedos, helados; mantener el portaobjetos a un ángulo de ~ 45 ° y permitir la suspensión de células a fluir sobre la superficie del portaobjetos. Coloque la corredera plana sobre papel de cocina y el diluvio de diapositivas con fijador y dejar secar al aire. Ver diapositivas para la presencia de los diferenciales mitóticas usando un microscopio invertido.

3. RNasa tratamiento y deshidratación de etanol

  1. Place 200 l de 10 mg / ml de RNasa A (Sigma) en 2 x SSC a cada diapositiva; incubar a 37 y deg; C durante 1 hr.
  2. Lavado de los portaobjetos 3 veces con 2X SSC, pH 7,0 a temperatura ambiente durante 3 min cada uno.
  3. Deshidratar desliza a través de una EtOH (Sigma) serie (70%, 90% y% 100) a temperatura ambiente durante 3 min cada uno.
  4. Secar las preparaciones a temperatura ambiente.

4. Preparación de cócteles Probe Plus para BAC centrómero del cromosoma específico Enumeración Probe (CEP) o para las pinturas de cromosomas enteros Hibridación in situ

  1. Para la hibridación BAC / PAC simultánea, preparar dos cócteles sondas separadas para pre-hibridación. Hemos encontrado que la pre-hibridación de las sondas de BAC y PAC por separado en los resultados de rigurosidades diferentes en menos de fondo y una mayor intensidad de señal. También hemos encontrado que fosmids individuales también se pueden utilizar en lugar de clones BAC. La formulación cóctel se describe a continuación representa los volúmenes para una sola diapositiva. Si el procesamiento de varias diapositivas utilizando las mismas sondas simplemente aumentar el parámetro adecuado volúmenes iately.

    * BAC ADN sonda cóctel:

    11,5 l de tampón de hibridación (50% formamida (Sigma) / 2 x SSC / sulfato de dextrano (Sigma)) 2 l dH 2 O

    2,5 l BAC/Cot1 ADN en dH 2 O (ver más abajo para el etiquetado de protocolo) 15 l volumen total

    * CEP sonda cóctel:

    7 l CEP tampón de hibridación (65% Formamide/2x SSC / sulfato de dextrano) 2 l dH 2 O

    1 l de ADN CEP/Cot1 (comprado prelabeled con Spectrum Orange/Cy3/Texas Rojo) 10 l volumen total

    * Después de la desnaturalización y pre-hibridación (paso 5.1) Mezcla de BAC sonda con CEP sonda en una relación 3:2 25 cócteles sonda l / diapositivas y mezclar.

    Oregón

  2. Alícuota de 20 l / portaobjetos de sonda completo con Paint cromosoma (Cy3/Texas Red) en un tubo. Proceder a la desnaturalización y la etapa de pre-hibridación.
"> 5. Deslice y desnaturalización de la sonda y la hibridación in situ

  1. Desnaturalizar la sonda cóctel (s) a 75 ° C durante 10 min. Pre-hibridación a 37 º C durante 30 min para permitir que el ADN de Cot1 para hibridar con secuencias repetitivas y para evitar la hibridación subsiguiente a cromosomas en metafase.
  2. Diapositivas desnaturalizar en frascos Coplin en Formamide/2x 70% SSC, pH 7,0 a 72 ° C durante 3 min.
  3. Inmediatamente deshidratar desliza a través de una serie de EtOH (70%, 90% y% 100) en frascos Coplin a 4 ° C durante 3 min cada uno.
  4. Deje que los portaobjetos se seque al aire a temperatura ambiente.
  5. Precalentar diapositivas a 45 ° C en la diapositiva más cálido de los últimos 10 minutos de la sonda de pre-La hibridación (paso 5.1). Mezclar pre-hibridizada cóctel sonda si es necesario y añadir 25 ul para cada diapositiva, coloque suavemente un cubreobjetos en cada diapositiva y el sello a lo largo de todos los bordes con cemento de goma. Incubar durante una noche a 37 ° C en una cámara humidificada para evitar la evaporación.

6. La hibridación del anuncio Lava

  1. Lavar los portaobjetos en frascos Coplin 3 veces en formamide/2x 50% SSC, pH 7,0, a 38-40 ° C durante 3 min cada uno. La temperatura de los lavados puede variar entre las sondas. Si no hay hibridación de fondo alta puede aumentar la temperatura de los lavados. A la inversa, si la señal es débil y no existen antecedentes entonces se puede disminuir la temperatura de estos lavados.
  2. Lavar los portaobjetos una vez en tampón de PN a temperatura ambiente durante 3 min, y pasar a la etapa de detección de BrdU.

7. BrdU detección

  1. Diapositivas de bloques con tampón de PNM durante 10 min (200 l / portaobjetos) a temperatura ambiente en la oscuridad.
  2. Escurrir las diapositivas mediante la activación de borde sobre una toalla de papel. Añadir 100 l de anti-BrdU-FITC (50 mg / ml o Millipore Roche) en tampón de PNM durante 30 min a 37 ° C.
  3. Lavar los portaobjetos 3 veces en tampón de PN a temperatura ambiente durante 3 min cada uno.
  4. Drenarel exceso de tampón de PN en portaobjetos de uno a la vez girando en el borde en una toalla de papel. Añadir 20 l DAPI / Antifade solución de montaje (Invitrogen). Cubrir el portaobjetos con una toalla de papel y presione el cubreobjetos para forzar la salida de burbujas de aire y el exceso de solución de montaje. Continúe con el análisis de imágenes.

8. La captura de imágenes y cuantificación de incorporación de BrdU

  1. Las imágenes se capturan con una Olympus BX61 microscopio de fluorescencia Olympus y la cámara CCD, 100x objetivo, rueda de filtros automáticos y software Cytovision (Applied Imaging). BrdU es capturado utilizando un filtro FITC; pinturas cromosoma (Texas Red, metasistemas o Cytocell), BAC (Cy3) y sondas de CEP (Vysis Spectrum Orange) se capturaron con una Red de Texas o el filtro de Cy3; DAPI se capta con un filtro DAPI (véase Las figuras 2 y 3).
  2. Cromosomas individuales de interés se identifican con BAC / PAC cromosoma o sondas específicas de pintura (Figuras 2B y 3B). Utilizandoel software Cytovision, cada cromosoma de interés es de "corte" de la propagación de metafase como un todo, se traza una línea a través del largo de la longitud del cromosoma de brazo corto de brazo largo (figuras 2C y 3C). El software Cytovision se utiliza para cuantificar el perfil de intensidad de los píxeles a lo largo de la longitud de cada cromosoma. El software Cytovision calcula el área ocupada por los píxeles y se cuantifica la intensidad de los píxeles representados por los BrdU o DAPI señales en cada cromosoma aislado. La intensidad de los píxeles promedio representada por cada cromosoma se multiplica por el área ocupada por los píxeles para obtener el número total de pixeles (Tabla 1 y Figura 4). Además, este protocolo permite la visualización de las últimas regiones de replicación de los cromosomas. En consecuencia, el patrón de bandas de incorporación de BrdU permite la detección de regiones de replicación activa de los cromosomas, y diferencias en el momento de replicación entre chromospares OMe se ve como diferencias en este patrón de bandas (Figuras 2 y 3). Por último, estas diferencias en los patrones de unión se puede comparar con conocidos mapas de replicación de tiempo para cada cromosoma 6,7, lo que permite una estimación de la diferencia de tiempo de replicación entre cromosomas homólogos o los brazos del cromosoma 4. Por ejemplo, el cromosoma dos 6 es en la Figura 3A muestran una diferencia en el patrón de bandas de> 2 hr cuando se compara con la temporización normal de replicación del cromosoma 6 4.
    Además, un procedimiento similar al descrito aquí se ha utilizado con éxito para el estudio de la replicación asíncrona de temporización entre los cromosomas X inactivo y activo 8,9. Los cromosomas X activos e inactivos se identificaron utilizando pinturas cromosoma X. Las imágenes se adquirieron usando Quips mFISH software (Vysis) y el número de píxeles ocupados por los cromosomas X y el número de píxeles ocupados por la fluorescenciabeled BrdU fueron calculados utilizando NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. Nick Traducción de BAC ADN de etiquetado fluorescente (Vysis)

  1. Agregue la mezcla de sondas siguiente a un tubo de microcentrífuga refrigerada:
    70 l (4 g de ADN) en dH 2 O
    10 l 0,2 mM dUTP-Naranja o Verde
    20 l .1 mM dTTP
    20 l 10x tampón de traducción Nick
    40 l NT dNTP (menos dTTP)
    40 l nick enzima Traducción
    Volumen total 200 l
    Incubar @ 16 ° CO / N. Detener la reacción por calentamiento a 70 ° C durante 10 min. Enfriar en hielo durante 5 min.
  2. Se precipita el ADN con etanol añadiendo lo siguiente a la mezcla de sondas:
    200 l solución de sonda
    48 l 3 M NaOAc
    160 l Cot1DNA (.25 mg / ul)
    1.200 l de EtOH 100%
  3. Almacenar a -80 º C durante 10 min a O / N.
  4. Girar in frío a 12.000 xg durante 20 min. Decantar EtOH. Lavar 1 vez con 70% EtOH. Girar como antes. Decantar EtOH. Deje secar al aire sólo hasta que se evapore EtOH. Resuspender en 40 l dH 2 O para una concentración final de 100 ng / l de ADN de BAC.

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Resultados

Un ejemplo del análisis de tiempo de replicación para el cromosoma 6 humano se muestra en la Figura 2. Las células que contienen una deleción del gen ASAR6 4, que se encuentra en 6q16.1, fueron expuestos a BrdU durante 5 h, se recogieron las células mitóticas y para peces con una sonda de cromosoma pintura 6 (Vysis) y para la incorporación de BrdU. Observe que no hay una diferencia significativa en el patrón de BrdU de bandas entre los dos 6, que es coherente con un retraso en el tiempo de re...

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Discusión

La preparación de extensiones de cromosomas es un paso crítico para el éxito de la replicación de temporización ensayo descrito aquí. La inclusión de una etapa de pretratamiento antes de la colcemid tratamiento hipotónico puede ayudar en la frecuencia y la propagación de las células mitóticas. Nos típicamente exponer las células a colcemdi de 1-3 h antes de la cosecha, y el uso colcemid a una concentración final de 10 ug / ml. Sin embargo, la inclusión de una etapa de pretratamiento colcemid puede alterar la longitud de...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer, CA131967.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre de Reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 g / l
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varía
LSI / WCP tampón de hibridación Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011
CEP tampón de hibridación Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001
Cromosoma paints Metasistemas Grupo D-14NN-050-TR
Olympus BX61 microscopio de fluorescencia Olimpo BX61TRF-1-5
Imágenes de microscopio software del sistema Applied Imaging Cytovision 3.93.1
Cámara Digital Olimpo UCMAD3

En las recetas de hibridación in situ
Soluciones Formamida
70% Formamide/2x SSC

35 ml * La formamida (Sigma)
10 ml de 10x SSC
5 ml d 2 H 2 0
pH a 7,0 con HCl (Sigma)

* Es importante utilizar formamida que se ha almacenado a -20 ° C. El almacenamiento prolongado temperatura ambiente va a generar ácido fórmico y el pH wenfermedad sea demasiado baja.

50% Formamide/2x SSC

25 ml de formamida (Sigma)
10 ml de 10x SSC
15 ml dH 2 O
pH a 7,0 con HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g de NaCl (Sigma)
358 g Citrato de Na (Sigma)
dH 2 O al volumen

PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)]

Hacer una solución 0,1 M de cada uno de fosfato de sodio (Filtro de esterilizar y almacenar en alícuotas de 500 ml).

0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L

13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma):
dH 2 O al volumen

0,1 M NaH 2 P0 4 1 L

14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma)
dH 2 O al volumen.

PN: Ajustar el pH de 0,1 M Na 2 HP0 4 a pH 8,0 con 0,1 M NaH 2 P0 4. Esterilizar por filtración y se añade 1 ml de NP-40.

PNM 50 ml

1,25 g leche descremada seca (Sigma)
25 ml tampón de PN (receta anterior)

Mezclar durante 15-20 min con agitación constante. Girar 2 veces a 400 xg durante 10 min. Utilice sobrenadante, y asegúrese de no molestar a las proteínas precipitadas leche.

Referencias

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