Mediante el etiquetado de los dominios extracelulares de los receptores de membrana con pHluorin superecliptic, y por imágenes de estos receptores de fusión en las neuronas de ratón en cultivo, se puede visualizar directamente los eventos de inserción individuales vesiculares de los receptores a la membrana plasmática. Esta técnica será fundamental para elucidar los mecanismos moleculares que regulan la inserción del receptor en la membrana plasmática.
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Artículo de método
Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Una mejor comprensión de los mecanismos que regulan el tráfico del receptor entre la membrana plasmática (PM) y los compartimentos intracelulares requiere un enfoque experimental con excelentes resoluciones espaciales y temporales. Además, este enfoque también debe tener la capacidad de distinguir los receptores localizados en el PM de aquellos en los compartimentos intracelulares. Lo más importante, la detección de los receptores en una sola vesícula requiere sensibilidad de detección relevante, ya que cada vesícula lleva sólo un pequeño número de receptores. Enfoques estándar para examinar el tráfico de receptores incluyen biotinilación superficie seguido por la detección bioquímica, que carece tanto de las resoluciones espaciales y temporales necesarias, y examen de microscopía de fluorescencia de receptores de superficie inmunomarcadas, lo que requiere la fijación química de las células y por lo tanto carece de suficiente resolución temporal 1-6. Para superar estas limitaciones, nosotros y otros han desarrollado y empleado una nueva estrategia que permite la visualización de la inserción dinámica de los receptores en el PM con excelentes resoluciones 7-17 espaciales y temporales. El enfoque incluye el etiquetado de un GFP sensible al pH, el superecliptic pHluorin 18, para el dominio extracelular N-terminal de los receptores. Superecliptic pHluorin tiene la propiedad única de ser fluorescente a pH neutro y no fluorescentes a pH ácido (pH <6,0). Por lo tanto, los receptores son etiquetados no fluorescente cuando está dentro del lumen de las vesículas ácidas de tráfico intracelular o los compartimentos endosomales, y se convierten fácilmente visualizadas sólo cuando se expone al entorno extracelular pH neutro, en la superficie exterior de la PM. Nuestra estrategia en consecuencia nos permite distinguir los receptores de superficie de las PM en vesículas intracelulares de tráfico. Para lograr suficientes resoluciones espaciales y temporales, así como la sensibilidad requerida para estudiar el tráfico dinámico de los receptores, se emplearon interna total reflejarmicroscopía fluorescente ion (TIRFM), lo que nos permitió lograr la resolución espacial óptima de imagen óptica (~ 170 nm), la resolución temporal de microscopía de vídeo-rate (30 fotogramas / segundo), y la sensibilidad para detectar la fluorescencia de GFP una sola molécula. Por pHluorin imagen marcada con receptores de bajo TIRFM, hemos sido capaces de visualizar directamente los receptores individuales de los eventos de inserción en el PM en las neuronas cultivadas. Este enfoque de formación de imágenes potencialmente se puede aplicar a cualquier proteína de la membrana con un dominio extracelular que podría etiquetarse con pHluorin superecliptic, y permitirá a la disección de los mecanismos clave modalidades de inserción de proteínas de membrana diferentes (receptores, canales iónicos, transportadores, etc) a la PM.
Protocolo
1. Preparación de Cultura del ratón para Glia acondicionado Cultura Neuronal
- Matraces T75 se recubren con una solución de colágeno (1:3 dilución de Purecol en ddH 2 O). Los matraces se colocará en posición vertical y se dejó secar durante la noche en una campana de cultivo de tejidos.
- Tampón de disección (LCRa: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 30 mM dextrosa, 25 mM HEPES, pH 7,4, sin calcio) y los medios de comunicación glía (DMEM suplementado con FBS al 10%, 10 unidades / ml de penicilina, 10 g / ml de estreptomicina, y Glutamax) se preparan y se almacenan a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
- En el día de la cultura glia, los medios de comunicación glía se calienta durante al menos 30 min en un baño a 37 ° C antes de la disección de los cerebros de ratón. Ratones embrionarios o neonatal son sacrificados por decapitación rápida. Cortezas cerebrales se diseccionan bajo un microscopio de disección.
- Disecados tejidos cerebrales son digeridos en solución de papaína (100 ml papaína y 20 l 1% de DNasa I en tampón de disección 2 ml) a 37 ° C for 20 min.
- Después de la digestión con papaína, los tejidos del cerebro se aclaró con 10 ml de medio glía precalentado. Medios frescos glía (2 ml) se añade entonces a los tejidos del cerebro digeridos, y los tejidos se trituraron con un pulido al fuego pipeta Pasteur de vidrio.
- Medios frescos glía (8 ml) se añade a los tejidos disociados. A 70 m de células colador se utiliza para filtrar la suspensión de tejido disociado. Después las células se sembraron en frascos T75 (usualmente 2-3 embriones pueden sembrar una matraz T75) y se colocaron en un 37 ° C incubadora de células de cultivo.
- El día siguiente, los medios de comunicación de los matraces T75 se aspira. Los matraces se enjuagaron con 10 ml de PBS. Medios frescos glía (10-15 ml) se añade a continuación a cada matraz.
- Dentro de 10-12 días, en las células de los matraces T75 debe ser confluente. Las células gliales se lavan con PBS, y 5 ml de tripsina al 0,05% se añade a cada matraz T75.
- Después de la incubación de tripsina a 37 º C durante 5 min, las células gliales son células disociadas y gliales de cada matraz T75 se dividen en dosdiferentes recubiertas con colágeno matraces T75.
- Insertos de cultivo (Millipore PICM03050) se preparan colocándolos en placas de 6-y, recubrimiento con colágeno, y secado con aire durante la noche. Medios de comunicación glía (2 ml cada uno) se coloca debajo de cada inserto de cultivo.
- Glia de matraces T75 confluentes se tratan con tripsina y se siembran en los insertos de cultivo (un matraz T75 por 6-así placa, 2 ml cada pieza de inserción). Estos insertos de cultivo de células gliales se utiliza para acondicionar los cultivos neuronales.
2. Cultura Neuronal
- Los cubreobjetos de vidrio para el cultivo neuronal se limpian por inmersión en 70% de HNO 3 al menos durante la noche. Los cubreobjetos se lavan a continuación con ddH 2 O por lo menos 3 veces, y se secó en un horno Isotemp (> 200 ° C) durante la noche.
- Cubreobjetos limpios se colocan en una placa de 6-así, un cubreobjetos por pocillo. Los cubreobjetos se recubren con poli-L-lisina solución (2 ml, 0,1% en ácido bórico 100 mM, pH = 8,5) durante la noche en una incubadora de 37 ° C.
- Lapoli-L-lisina solución se elimina de los cubreobjetos y los cubreobjetos se lavaron 3 veces con ddH autoclave 2 O. Los cubreobjetos se incuban a continuación en un 37 ° C durante la noche en medios galvánicos (Neurobasal suplementado con suero de caballo al 5% inactivado por calor, 10 unidades / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina, Glutamax incubadora; 2% suplemento B27 se añade al medio de chapado el día en que se utiliza).
- Al día siguiente, los medios de deposición se retira y 2 ml de medio fresco con enchapado de B-27 se añadieron a cada pocillo que tiene un cubreobjetos de vidrio.
- Ratones embarazadas (E15-18) son sacrificados con el CO 2, y embriones de ratones son sacrificados por decapitación. El hipocampo o estriado se disecciona el tejido cerebral y se colocó en un tubo cónico de 15 ml con tampón enfriado con hielo disección, para el cultivo de neuronas del hipocampo o estriatal neuronas espinosas medias, respectivamente.
- Disecados tejidos cerebrales se disocian con papaína como se describe en los pasos 1,4) y 1,5).
- Fespués de disociación, el número de células en cada suspensión neuronal se contaron con un hemocitómetro. Las neuronas se sembraron entonces sobre cada cubreobjetos a una densidad de 0,4 x 10 6 células por pocillo de una placa de 6 pocillos y se cultivaron en una incubadora de 37 ° C durante la noche (las neuronas son DIV 0).
- Para preparar insertos glía de cultivo para el acondicionamiento de los cultivos neuronales, los medios de comunicación glía se elimina de los insertos de cultivo de células gliales y medianas recubrimiento fresco se añade (2 ml en el inserto y 2 ml debajo de la pieza de inserción).
- El día siguiente (DIV 1), los cubreobjetos con las neuronas se colocan debajo de los insertos de cultivo glia, un cubreobjetos en cada pocillo.
- Las neuronas se alimentan con medio fresco que el volumen de los medios de alimentación pre-calentado (con B-27) cada 3-4 días hasta que están listas para experimentos de transfección y de imagen.
3. Transfección
- Neuronal transfección se realiza usando Lipofectamine 2000. Para cada cultivo neuronal (un cultivo por cubreobjetos), 2 lLipofectamine 2000 y 1 ug de ADN se utilizan. Medio fresco Neurobasal sin suplemento se usa para diluir Lipofectamine y ADN.
- ADN y Lipofectamine se incuban durante 20 min a temperatura ambiente después de la mezcla.
- Guardar 1 ml de los medios de debajo de cada inserto de cultivo glia, y 1 ml desde el interior de cada inserto, y transferir los medios de comunicación a un tubo cónico. Añadir el mismo volumen de medios de alimentación + B27 al medio de salvado y se incuba a 37 ° C. Este medio se utiliza para el cultivo neuronal después de la transfección.
- Después de la 20-min Lipofectamine / ADN incubación, insertos glía de cultivo se retira momentáneamente de las placas 6-y. El 200 l Lipofectamine / ADN mezcla se añade a cada cubreobjetos con las neuronas. Los insertos de cultivo de células gliales se devuelven luego a cada pocillo, por encima de las neuronas. Generación de burbujas debajo de la membrana de los insertos de cultivo debe ser evitado. Las neuronas se incubaron con la mezcla de Lipofectamine / ADN a 37 ° C durante 2-4 h.
- Después de the 2-4 hr período de incubación, las inserciones glía se retiran de nuevo. Los medios de cultivo con la mezcla de Lipofectamine / ADN se retiraron de cada pocillo. Los medios guardados en el paso 3,3) se añade a las neuronas (2 ml por pocillo). Glia insertos de cultivo se devuelven a cada pocillo, y los medios de comunicación glía de cada inserto se retira, y 2 ml de los medios de paso 3,3) se añadió a cada inserto.
- Las neuronas se cultivaron durante 24-72 horas para permitir la expresión de cDNA transfectadas antes TIRF formación de imágenes se realiza en estas neuronas.
4. TIRF imágenes
- Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM de glucosa, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM de HEPES, pH = 7,4) se utiliza para los experimentos de formación de imágenes en vivo. Nuestro sistema de imagen TIRF es costumbre puesta a punto con un láser de 100 mW Cian para la excitación, y una carga del electrón Multiplicando Coupled Device (EMCCD) de la cámara por un detector.
- Antes de los experimentos de imagen, la LCRa se advirtió en un 37 & dpor ejemplo, baño de agua C durante al menos 30 min. El inserto de calefacción para formación de imágenes en vivo se coloca en la platina del microscopio, y el inserto de calefacción, el láser y la cámara se calienta durante al menos 30 min antes del inicio de los experimentos de imagen.
- Un cubreobjetos con neuronas transfectadas se monta en la cámara de formación de imágenes en vivo. El LCRa pre-calentado se coloca en la cámara después de que la cámara está montada, este paso debe ser completado tan pronto como sea posible.
- Una vez que la cámara se coloca en el inserto de calefacción en la platina del microscopio, las neuronas transfectadas se identifican visualmente bajo el modo de formación de imágenes epi-fluorescente.
- Después sanos neuronas transfectadas se identifican (consulte las Figuras 1 y 2), se realizan típicamente 1 min de foto-blanqueador para eliminar la pre-existente pHluorin fluorescencia en la membrana plasmática, como pHluorin-receptores en la membrana plasmática tienen niveles de fluorescencia muy alta cuando TIRF imágenes por primera vez, lo que interfiere con la visualización de ins individuoertion eventos.
- Después de fotoblanqueador, el ajuste de ganancia del multiplicador de electrones en la cámara EMCCD se ajusta al máximo, y la grabación se realiza durante 1 min a 10 Hz.
- Cada registro contendrá 600 imágenes. Los eventos individuales de inserción se identifican por jugar la parte de atrás de grabación usando ImageJ. Los eventos individuales de inserción se analizaron manualmente usando ImageJ.
5. Los resultados representativos
Cultivo neuronal consistente es la clave para el éxito de formación de imágenes en vivo-experimentos. Figura 1 muestra las neuronas del hipocampo de ratón cultivadas usando el protocolo de DIV 11 a DIV 18. Es evidente a partir de las imágenes que las neuronas han desarrollado procesos extensos y que los procesos dendríticos son cubiertos densamente con las espinas dendríticas, las indicaciones de que estas neuronas son saludables en cultivo. Nuestro protocolo de cultivo también podría ser utilizado para otros tipos de neuronas en el cerebro. Por ejemplo, recientemente hemos usado este protocolo a la culturaestriatal neuronas espinosas medias en un estudio para examinar los receptores de dopamina D2 (DRD2) inserción en cultivos de ratón estriatal neuronas espinosas medias 9. Figura 2 muestra ratón estriatal neuronas espinosas medias cultivadas utilizando nuestro protocolo en DIV 8. También hemos realizado con éxito TIRF imágenes de superecliptic DRD2s pHluorin-etiquetados en este tipo de neurona. Figura 3 muestra la expresión de pHluorin-etiquetados DRD2 (pH-DRD2) en una neurona espinosa medio y visualización de pH-DRD2 inserción en esta neurona.
Figura 1. Hipocampo de ratones de cultivo utilizando el método de cultivo de interfaz. DIV: días in vitro, el día de la cultura se considera como DIV 0. De las imágenes, es evidente que las neuronas del hipocampo maduros en este tipo de cultivo entre 11 DIV y DIV 15. En DIV 11 y 13, las dendritas neuronales están cubiertos con filipodia y espinas inmaduras. En DIV 15 y18, las dendritas neuronales están cubiertos por espinas grandes, una indicación de más neuronas maduras. Paneles izquierdo: bajo aumento imágenes de las neuronas del hipocampo de ratones de diferentes edades. Paneles de la derecha: imágenes de gran aumento (zoom en las dendritas neuronales del panel de la izquierda) de los procesos neuronales dendríticas con las espinas dendríticas en las diferentes edades.
Figura 2. Ratón espinoso neurona estriatal medio de cultivo utilizando el método de cultivo de interfaz. Las neuronas de las imágenes están en DIV 8.
Figura 3. Un ratón medio estriatal neurona espinosa transfectadas con super eclíptica pHluorin marcada con receptor de dopamina D2 (DRD2 pH). Imagen de la izquierda es la proyección de intensidad máxima de la grabación de lapso de tiempo (600 imágenes, 100 ms por imagen). Puntas de flechas blancas indican inserción individual de pH vesicular-DRD2. Esta imagen retiene la información de la inserción en la dimensión XY pero pierde la información de tiempo. Imagen de la derecha muestra la proyección yt intensidad máxima, en el que la pila XYT se gira 90 grados alrededor del eje y, y el máximo de píxeles en cada línea del eje x se proyecta sobre un único eje y pixel. Esta imagen retiene la información de inserción a lo largo del eje yt pero pierde la información eje x.
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Discusión
Por razones desconocidas, las neuronas de ratón son siempre más difíciles de cultivar que las neuronas de rata. En nuestra experiencia, un cultivo mixto de las neuronas y las células gliales funciona bien para los principales cultivos de neuronas de ratón. Sin embargo, como un cultivo mixto no es adecuado para TIRF experimentos de imagen, como en este tipo de neuronas de cultivo y sus procesos tienden a crecer en la parte superior de células de la glia, situando la somata neuronal y procesos dendríticos más allá del alc...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por fondos de puesta en marcha del Laboratorio Jackson.
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Materiales
Dulbecco Buffered Saline (DPBS)
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios | |||
| Purificado solución de colágeno bovino (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank solución salina equilibrada (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| Penicilina-estreptomicina (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| Piruvato de sodio | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM alto en glucosa | GIBCO | 10313-021 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| Papaína | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| I de páncreas bovino desoxirribonucleasa (DNasa I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| GIBCO | 14190-144 | ||
| Tripsina 0,05% | GIBCO | 25300-054 | |
| Poli-l-lisina hidrobromuro | SIGMA | P2636-1G | |
| Ácido bórico | Fisher Scientific- | BP 168-500 | |
| Medio Neurobasal | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 libre de suero Suplemento | GIBCO | 17504-044 | |
| Calor inactiva suero de caballo | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific- | BP310-500 | |
| Cultura Insertar | Millipore | PICM03050 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
