Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

Resumen

Mediante el etiquetado de los dominios extracelulares de los receptores de membrana con pHluorin superecliptic, y por imágenes de estos receptores de fusión en las neuronas de ratón en cultivo, se puede visualizar directamente los eventos de inserción individuales vesiculares de los receptores a la membrana plasmática. Esta técnica será fundamental para elucidar los mecanismos moleculares que regulan la inserción del receptor en la membrana plasmática.

Resumen

Una mejor comprensión de los mecanismos que regulan el tráfico del receptor entre la membrana plasmática (PM) y los compartimentos intracelulares requiere un enfoque experimental con excelentes resoluciones espaciales y temporales. Además, este enfoque también debe tener la capacidad de distinguir los receptores localizados en el PM de aquellos en los compartimentos intracelulares. Lo más importante, la detección de los receptores en una sola vesícula requiere sensibilidad de detección relevante, ya que cada vesícula lleva sólo un pequeño número de receptores. Enfoques estándar para examinar el tráfico de receptores incluyen biotinilación superficie seguido por la detección bioquímica, que carece tanto de las resoluciones espaciales y temporales necesarias, y examen de microscopía de fluorescencia de receptores de superficie inmunomarcadas, lo que requiere la fijación química de las células y por lo tanto carece de suficiente resolución temporal ^1-6. Para superar estas limitaciones, nosotros y otros han desarrollado y empleado una nueva estrategia que permite la visualización de la inserción dinámica de los receptores en el PM con excelentes resoluciones ^7-17 espaciales y temporales. El enfoque incluye el etiquetado de un GFP sensible al pH, el superecliptic pHluorin ^18, para el dominio extracelular N-terminal de los receptores. Superecliptic pHluorin tiene la propiedad única de ser fluorescente a pH neutro y no fluorescentes a pH ácido (pH <6,0). Por lo tanto, los receptores son etiquetados no fluorescente cuando está dentro del lumen de las vesículas ácidas de tráfico intracelular o los compartimentos endosomales, y se convierten fácilmente visualizadas sólo cuando se expone al entorno extracelular pH neutro, en la superficie exterior de la PM. Nuestra estrategia en consecuencia nos permite distinguir los receptores de superficie de las PM en vesículas intracelulares de tráfico. Para lograr suficientes resoluciones espaciales y temporales, así como la sensibilidad requerida para estudiar el tráfico dinámico de los receptores, se emplearon interna total reflejarmicroscopía fluorescente ion (TIRFM), lo que nos permitió lograr la resolución espacial óptima de imagen óptica (~ 170 nm), la resolución temporal de microscopía de vídeo-rate (30 fotogramas / segundo), y la sensibilidad para detectar la fluorescencia de GFP una sola molécula. Por pHluorin imagen marcada con receptores de bajo TIRFM, hemos sido capaces de visualizar directamente los receptores individuales de los eventos de inserción en el PM en las neuronas cultivadas. Este enfoque de formación de imágenes potencialmente se puede aplicar a cualquier proteína de la membrana con un dominio extracelular que podría etiquetarse con pHluorin superecliptic, y permitirá a la disección de los mecanismos clave modalidades de inserción de proteínas de membrana diferentes (receptores, canales iónicos, transportadores, etc) a la PM.

Protocolo

1. Preparación de Cultura del ratón para Glia acondicionado Cultura Neuronal

1. Matraces T75 se recubren con una solución de colágeno (1:3 dilución de Purecol en ddH ₂ O). Los matraces se colocará en posición vertical y se dejó secar durante la noche en una campana de cultivo de tejidos.
2. Tampón de disección (LCRa: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl _2, 30 mM dextrosa, 25 mM HEPES, pH 7,4, sin calcio) y los medios de comunicación glía (DMEM suplementado con FBS al 10%, 10 unidades / ml de penicilina, 10 g / ml de estreptomicina, y Glutamax) se preparan y se almacenan a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
3. En el día ....

Discusión

Por razones desconocidas, las neuronas de ratón son siempre más difíciles de cultivar que las neuronas de rata. En nuestra experiencia, un cultivo mixto de las neuronas y las células gliales funciona bien para los principales cultivos de neuronas de ratón. Sin embargo, como un cultivo mixto no es adecuado para TIRF experimentos de imagen, como en este tipo de neuronas de cultivo y sus procesos tienden a crecer en la parte superior de células de la glia, situando la somata neuronal y procesos dendríticos más allá del alc.......

Materiales

Dulbecco Buffered Saline (DPBS)

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios
Purificado solución de colágeno bovino (Purecol)	Advanced Biomatrix	5005-B
Hank solución salina equilibrada (HBSS)	GIBCO	14185-045
Penicilina-estreptomicina (Pen Strep)	GIBCO	15140-122
Piruvato de sodio	GIBCO	11360-070
DMEM alto en glucosa	GIBCO	10313-021
Suero fetal bovino (FBS)
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
Papaína	Worthington Biochemical Corp.	LS003126
I de páncreas bovino desoxirribonucleasa (DNasa I)	SIGMA	DN25-10MG
GIBCO	14190-144
Tripsina 0,05%	GIBCO	25300-054
Poli-l-lisina hidrobromuro	SIGMA	P2636-1G
Ácido bórico	Fisher Scientific-	BP 168-500
Medio Neurobasal	GIBCO	21103-049
B-27 libre de suero Suplemento	GIBCO	17504-044
Calor inactiva suero de caballo	GIBCO	26050-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668 019
HEPES	Fisher Scientific-	BP310-500
Cultura Insertar	Millipore	PICM03050