Microinyección insulina hipocampo y<em&gt; En vivo</em&gt; Microdiálisis durante la prueba de memoria espacial

Resumen

La modulación de hippocampally dependiente de memoria de trabajo espacial mediante microinyección intrahipocampal directo, acompañado y seguido de In vivo Microdiálisis para metabolitos en animales conscientes y se comportan.

Resumen

Metabolismo de la glucosa es un marcador útil para la actividad neuronal local, formando la base de métodos tales como la resonancia de 2-desoxiglucosa y magnética funcional. Sin embargo, el uso de tales métodos en modelos animales y por lo tanto requiere anestesia tanto altera el estado del cerebro y previene medidas de comportamiento. Un método alternativo es el uso de la microdiálisis in vivo para tomar la medición continua de las concentraciones cerebrales de fluidos extracelulares de los metabolitos de la glucosa, lactato, y similares en animales despiertos, sin restricciones. Esta técnica es especialmente útil cuando se combina con las tareas diseñadas para confiar en regiones específicas del cerebro y / o la manipulación farmacológica aguda, por ejemplo, las mediciones del hipocampo durante una tarea de memoria de trabajo espacial (alternancia espontánea) muestran un descenso de la glucosa extracelular y aumento del lactato que son sugerente de ^1,2 glucólisis mejorada, y la administración de insulina intrahipocampal tanto mejora la memoria y aumenta glicol hipocampolisis ^3. Sustancias tales como la insulina puede ser entregado a la hipocampo a través de la sonda de microdiálisis mismo que se utiliza para medir metabolitos. El uso de alternancia espontánea como una medida de la función del hipocampo está diseñado para evitar cualquier confundir motivadores de estrés (por ejemplo choque eléctrico), restricción, o recompensas (por ejemplo, alimentos), todos los cuales pueden alterar tanto la ejecución de tareas y el metabolismo; esta tarea también proporciona un medir la actividad motora que permite el control de los efectos no específicos del tratamiento. Combinados, estos métodos permiten la medición directa de las variables neuroquímicos y metabólicos que regulan el comportamiento.

Protocolo

1. Preparación para la Cirugía

1. Manipulación. Animales (más comúnmente, ratas o ratones, aunque el método de microdiálisis y combinación con las pruebas de comportamiento es en gran medida una general con cualquier requeridas especies específicas de las adaptaciones necesarias, por ejemplo, para la anestesia) se controlan durante un mínimo de 10 min / día durante por lo menos dos días antes de la cirugía. Manipulación extensa se ​​ha demostrado que dejar a los animales en un estado no forzado en el momento de la prueba, evitando confundir posible ^2,4,5. Vamos a utilizar las ratas a través de este protocolo como una especie de ejemplo. Manipulación debe hacerse sin tensión causada tirando de la piel de látex o nitrilo por ejemplo: esto puede lograrse mejor con las manos desnudas, en consulta con el veterinario instalaciones y los funcionarios de salud de los empleados. Si esto no es posible, guantes de algodón suave debe usarse sobre guantes de barrera para evitar tirar en la piel de las ratas.
2. Preparación del campo estéril. Antes de comenzar la cirugía, el Surgical área se prepara, un campo estéril preparado alrededor del aparato estereotáxico y un campo estéril colocado a través del aparato, que cubre una almohadilla de calefacción que se utiliza para mantener la temperatura corporal de la rata. Una almohadilla circular agua caliente con termostato precisa se utiliza para evitar el sobrecalentamiento del animal.
3. Anestesia de inducción. El vaporizador de isoflurano se comprueba para contener niveles óptimos de isoflurano y se conecta a la cámara de inducción. Las conexiones se comprueba para confirmar un bucle cerrado. El sistema de vacío de manejo de aire es controlada para ser operativo. Vaporización isoflurano se enciende y el animal se coloca en la cámara de inducción utilizando isoflurano un 5% en la mezcla de oxígeno: es decir, 5% de isoflurano añadió en una corriente de 100% de oxígeno y entregado a la cámara de inducción.
4. La colocación en el aparato. Los animales se fijan en el aparato estereotáxico utilizando earbars y una barra de diente. Corregir earbar La colocación de una cabeza inmóvil y oídos que estén planas a lo largo de los earbars. Animalesson rápidamente montada y la nariz se inserta en un tetón cónico diseñado a propósito anestésico; entrega de vaporizado isoflurano se conmuta desde la cámara de inducción a la ojiva y la mezcla anestésica ajustaron para suministrar 2-3% de isoflurano en la corriente de oxígeno que va a la ojiva.
5. Confirmación de la anestesia. Un plano anestésico quirúrgico se confirma mediante la entrega de una pizca duro para el pie y un soplo de aire a la vista, ni debe causar ninguna respuesta. Estas pruebas se repiten a intervalos de aproximadamente 15 min a lo largo de la cirugía para confirmar el mantenimiento de un plano quirúrgico de anestesia. El pelo se elimina del lugar de la incisión antes de entrar en el campo estéril.

2. Cirugía

1. Tratamiento inicial animal. Pomada oftálmica se aplica a cada globo ocular para evitar el secado. 1 ml de solución salina estéril se da sc para evitar la deshidratación durante la cirugía, y el cuerpo está cubierto con una sábana estéril. Betadine se aplica al cuero cabelludo, y extrajo de la parte centrocon un hisopo de algodón; 70% de etanol se limpió de manera similar, y los dos pasos de hisopado se repitió dos veces más para asegurar un apropiado sitio de la incisión. Tiempo de contacto de la piel para betadine y alcohol debería ser de al menos 3 minutos antes de la incisión. La anestesia se mantiene y verificarse periódicamente durante toda la cirugía; una sola inyección sc de carprofeno 5 g / kg) se administra para iniciar la analgesia, y se utiliza una técnica aséptica. La analgesia se da después de la inducción de la anestesia para minimizar el estrés de la inyección.
2. Incisión y preparación cráneo. Un corte 3-4 cm se hace sagitalmente en el centro del cráneo. Una mezcla 1:1 de bupivicaína: epinefrina se aplica tópicamente para proporcionar analgesia adicional y minimizar el sangrado. El cuero cabelludo se mantiene lejos de la incisión con grapas quirúrgicas y los hisopos estériles se utilizan para eliminar las membranas que recubren el cráneo. Coordenadas para la perforación se miden utilizando bregma como punto de referencia, marcado con una broca estéril (o, alternativamente, una mano cauterio device), y volvió a confirmar su exactitud antes de iniciar la perforación. Coordenadas para regiones específicas del cerebro de interés (por ejemplo, aquí el hipocampo) se determinan utilizando un atlas del cerebro. Por microdiálisis del hipocampo, usamos un sitio de perforación a 5,6 mm posterior a bregma, 5,0 lateral, y 3,0 ventral desde la duramadre.
3. Perforación. Tres agujeros son perforados a través del cráneo, teniendo cuidado de aplicar sólo una fuerza mínima tal que el trauma a la duramadre y las membranas subyacentes es mínima o ausente. Un orificio es medido en el sitio de la cánula de inserción, los otros dos se posicionan como conveniente para la inserción de tornillos cráneo. Propósito de tamaño-tornillos (por ejemplo, 1,17 mm tornillos autorroscantes; herramientas finas Science) se insertan en estos agujeros sin impactar en el cerebro por debajo, y se utilizan como puntos de anclaje para la posterior aplicación de cemento dental.
4. Cánula colocación y cierre. La cánula se coloca en la inserción coordenadas, que se volvió a confirmar que es el sitio del agujero taladrado,y luego se bajó lentamente a la profundidad del objetivo. Una vez colocado correctamente, la cánula se fija en posición con cemento dental. Si es necesario, una sola sutura quirúrgica estéril se utiliza para cerrar la herida. Un estilete se inserta en la cánula para mantener la permeabilidad. En este protocolo se utiliza una sonda CMA12 y guía cánula (CMA / microdiálisis).
5. Aguda atención postquirúrgica. 3 ml de solución salina estéril se administra sc para continuar la hidratación; una sola inyección sc de carprofeno 5 g / kg) también se da a iniciar analgesia. Los animales se retira del aparato y se coloca en una sala de recuperación calentada, en una jaula limpia, y hasta que se encuentren completamente recuperado de la anestesia. La recuperación completa se evalúa mediante la restauración de corregir la locomoción refleja y normal. Los animales son devueltos a sus jaulas y sala de espera regular.
6. A corto plazo, la atención de seguimiento. Las jaulas de animales que han sido sometidos a cirugía están marcados con la fecha de la cirugía. Los animales son monitoreados por lo menos una vez al día durante al menos tree días después de la cirugía, y dieron una tableta masticable carprofeno (2 mg) en el día después de la cirugía y cada uno de los dos días siguientes. Si los animales no consumen el carprofeno, carprofeno inyectable se puede administrar para asegurar una analgesia adecuada. Controlar tanto el estado general de salud del animal y el estado de la herida (por infección, enrojecimiento, etc) siguiendo las directrices institucionales de cuidado de animales y la búsqueda de ayuda o asesoramiento por parte del personal de cuidado de animales o al veterinario si es necesario. Es importante destacar que señalar que la manipulación adecuada y la aclimatación al experimentador es esencial: los animales deben ser manipuladas en exceso, incluyendo la manipulación de la cánula, hasta que ninguna señal de nerviosismo o estrés se mantiene cuando es manipulado por el experimentador.
7. Cuidado de los animales y el tratamiento posterior. Los animales se siguen los procedimientos de ensayo adecuados, y la eutanasia de acuerdo con el protocolo aprobado y su grupo experimental específico.

3. Microdiálisis (MD)

1. Perfuscomió su preparación. Fluido extracelular artificial (AECF) se hace con 153,5 mM Na, 4,3 mM de K, Mg 0,41 mM, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl, 1,25 mM de glucosa, tamponada a pH 7,4 ⁶ cuenta que la composición precisa del líquido es esencial:. Inexactitudes o utilizar de otros fluidos, menos fisiológicos tales como la de Ringer o PBS para microdiálisis dará lugar a resultados erróneos marcadamente ^6. Específicamente, en cuenta que la composición iónica del fluido extracelular (ECF) no es la misma que la de la CSF, como se demostró en un estudio detallado 2004 de la ECF hipocampo ^6. En el día de la prueba, albúmina de suero bovino (BSA) se añadió a 2% peso / peso y se disolvió completamente, lo que reduce la pérdida de péptidos tales como insulina de la adhesión a la tubería, y también reduce el riesgo de pérdida de fluido (ultrafiltración) en la membrana de la sonda. Después de la preparación, el perfundido debe filtró a través de un filtro de 0,2 micras.
2. Si un tratamiento tal como la insulina es para ser entregado a la sujetadoren la región de interés (aquí el hipocampo), preparar este tratamiento utilizando una parte alícuota de la AECF preparada con la concentración apropiada de fármaco. Para la insulina, una concentración de 400 nM (66,7 mU / l) para la entrega a través de microdiálisis inversa se ​​ha demostrado que afectan metabólica del hipocampo y la función cognitiva ^7. Tenga en cuenta que la concentración en el tejido resultante de la insulina no se mide aquí y sigue siendo desconocido.
3. Configuración de sonda mD y líneas. Preparar una sonda de microdiálisis fresco y la línea de días antes de la prueba. Crear dos líneas separadas de "entrada" y "salida". Use PE50 tubo para conectar dos 1 metro largas piezas de tubos de FEP y asegurarse de que hay un mínimo espacio muerto entre las líneas. Conectar la tubería de entrada a una jeringa de 1 ml Hamilton lleno de filtrado estéril, desionizada H ₂ 0 (0 dH _2), y luego conectar a la sonda.
4. Microdiálisis giratorio. Para permitir el movimiento libre de los animales al realizar la medición, conectar un eslabón giratorio líquido para la iNFLOW y líneas de flujo de salida, cerca de la bomba, usando tubos de FEP adicional. Recuerde llevar el volumen interno de este giratoria y el tubo en cuenta en la consideración de tiempo de recolección de la muestra (a continuación).
5. La creación de la bomba mD. Encender la bomba MD y funcionar a 1,5 l / min hasta que vea dH ₂ 0 sale del tubo de salida de la sonda. Entonces, mientras la bomba está apagada, conecte la otra línea entre el tubo de salida y un tubo de recogida de muestras. Ejecute 5 ml a través del tubo y coloque la sonda en un vial que contiene estéril dH ₂ 0 durante la noche, asegurarse de que la punta de la sonda se mantiene siempre húmeda.
6. Pre-Prueba sujeto de prueba. 24 h antes de la prueba, retire el estilete maniquí de cabeza de la rata e insertar una sonda mD (sólo se utiliza para este propósito, no para el muestreo) por 10 min. Luego vuelva a colocar el estilete maniquí y colocar a la rata de nuevo en su jaula. Este procedimiento está diseñado para minimizar cualquier efecto de gliosis reactiva en el día de la prueba ⁸ y en nuestras manos, esto da una buena Results que coincidan con los datos de otras técnicas y parecen reflejar la activación del hipocampo ^2,5,7,9; otros han utilizado un enfoque similar que sale de la sonda en su lugar durante 24 horas antes de la medición, que también es un buen enfoque si el daño a la sonda durante la noche puede ser evitado.
7. Sonda de equilibrado. En el día de microdiálisis, llenar la jeringa Hamilton y vial de centelleo con AECF filtró y se bombean a través de equilibrar durante 1 hr. Si es necesario, llenar una segunda jeringa Hamilton con tratamiento preparada (por ejemplo, insulina AECF) y ponerlo en la bomba de jeringa.
8. Sonda de inserción. Cuando el equilibrio, retire el estilete ficticia e inserte suavemente la sonda mD equilibrada en el cerebro de la rata a través de la cánula. Coloque la rata en una caja de plástico transparente que contiene algunas de las camas casa de la rata. Asegúrese de que para contrarrestar el tubo: adjuntar un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml lleno de agua a la tubería fuera de la jaula de tal manera que la gravedad mantiene el microdilíneas de estudio de carácter unkinked, pero no tensos. Vamos sonda equilibrar en rata durante 2 horas. Al comienzo de este período, confirmar que el flujo de líquido de perfusión se desbloquea: este se hace más fácil mediante la recopilación de salida de líquido de perfusión durante un período definido y pesando la muestra para confirmar que el volumen esperado se sale del sistema. Cualquier sonda que los rendimientos de <90% del volumen esperado, y no se auto-corrección después de la extracción y reinserción, se debe sustituir (por lo demás edema en la punta de la sonda se traducirá). Si el flujo es persistentemente baja o nula, revise todas las conexiones en busca de fugas, en su defecto, desconecte la tubería en etapas para ver si la obstrucción puede ser aislado. Si el problema no se identifica, sustituir la sonda, si el problema no se resuelve, puede ser necesario empezar de nuevo con nueva sonda y las líneas de la sección 3.3. El periodo de equilibración de dos horas permite la barrera sangre-cerebro para volver a sellar alrededor de la sonda y evitar cualquier efecto agudo de la inserción de la sonda.
9. Recogida de muestras. Asegúrese de que la correlation entre diálisis de la muestra (del cerebro) y la recolección (en el tubo) es calcular con exactitud. Por ejemplo, el uso de dos metros de tubo FEP entre giratorio y la sonda, hay un volumen total entre la sonda y la colección de 30 l y por lo tanto se tarda 20 min a 1,5 l / min Tasa de flujo de la muestra pase a través de la sonda, tubos, conectores y girar para alcanzar el extremo del tubo para la recogida. Cuando la recolección de muestras asegurar que recoja el volumen suficiente como para tener la concentración necesaria para sus ensayos. Aquí, vamos a utilizar 5 contenedores de muestra min, y así recaudar 7,5 l de líquido de diálisis en cada tubo de recogida.
10. Muestras de referencia. Una vez que el equilibrio se ha completado, comienza la recogida de muestras. Recoger por lo menos tres muestras mientras que la rata está en reposo en la cámara de casa para establecer una línea de base estable de mediciones
11. Tratamiento de temporización. Tenga cuidado al calcular el tiempo necesario para iniciar el tratamiento antes del experimento: recuerda que así como hay un lapso de tiempo entre la diálisisy recogida de muestras, existe un retraso (normalmente idénticas) entre perfundido dejando la jeringa y llegando al hipocampo del animal. Por lo tanto, en nuestra configuración con un volumen de 30 l entre la jeringa y la sonda, cambie la jeringa que contiene el tratamiento perfundido 20 minutos antes de que desea que el tratamiento para comenzar a llegar en el hipocampo.
12. Cambio de jeringas. Un interruptor de líquido se puede utilizar, si se desea, pero no es necesario: en el momento apropiado, simplemente desconectar la línea de flujo de entrada desde la jeringa de control-perfundido rápidamente y conectarse a la jeringa con el tratamiento perfundido. Esto no debe tomar más de 5 segundos para evitar la interrupción significativa al flujo de perfusión. NOTA de que este proceso debe ser revertido después de la dosificación deseada ha sido entregado, si una entrega limitada en el tiempo de tratamiento que se desea. Alternativamente, el tratamiento puede continuar durante la duración de la toma de muestras (véase la Figura 2). Las burbujas de aire no debe ser introducido en la línea durante la conmutación dejeringas, ya que pueden acumularse en la membrana de diálisis y reduce la eficiencia de la sonda.
13. Las pruebas de comportamiento. Si se realiza una tarea de comportamiento, siga este procedimiento (ver sección 4). NOTA que la coordinación con la administración del tratamiento en el hipocampo es importante. Por ejemplo, la entrega de insulina debe ser programada para producir 10 min antes de la prueba comenzando ^10. Por lo tanto, el cambio a un líquido de perfusión que contiene insulina debe ocurrir 30 min antes de las pruebas de comportamiento (20 min de perfusión pase a través de las líneas 10 min más tiempo deseado de entrega antes de la prueba).
14. Finalización de la recogida de muestras. Después de recoger las muestras deseadas, retire suavemente la sonda de la cabeza del animal, recordando de nuevo a tener en cuenta desfase de tiempo entre la diálisis y toma de muestras. Volver al animal a su jaula y observar de cerca cualquier cambio post-experimental en la salud o el comportamiento hasta que el animal muere y el cerebro removido para confirmar la correctacolocación de la sonda. Si el sacrificio no ocurrirá inmediatamente, devuelva el estilete maniquí a la cánula para evitar la introducción de material extraño.
15. Análisis. La metodología analítica variará dependiendo del analito (s) de interés. Dado que el muestreo de diálisis no permitir el equilibrio completo analito en la membrana de la sonda, concentraciones de la muestra debe ser corregida para dar concentraciones utilizando el método ECF cero neto de flujo ^11,12.

4. Las pruebas de comportamiento

1. La ubicación en el laberinto. Después de muestras de línea de base (es decir, después de al menos tres muestras de haber completado la diálisis, pero todavía puede estar en el tubo de flujo de salida se recogió), mover suavemente la rata en el aparato de ensayo de comportamiento. Cualquier tarea apropiada puede ser usado; los datos de la Figura 1 se obtuvieron utilizando una de cuatro brazos en forma de laberinto plus y la medición de alternancia espontánea, que es una medida de la memoria de trabajo espacial: la rata se coloca inicialmente en el center del laberinto y se les permite explorar libremente ^9,13. Debido a que cualquier prueba de comportamiento puede ser utilizado, el enfoque de este protocolo no está en la tarea específica utilizada como un ejemplo aquí (que se detalla en otras partes ^9,14,15), pero en breve, los animales se les permite explorar el laberinto (el período de el recuadro gris en la Figura 1) y utilizar hippocampally procesos dependientes de conservar la memoria de los brazos que recientemente se han visitado.
2. Diálisis movimiento tubos durante la prueba. Sujete el tubo de tal manera que se mueve libremente, ni obstaculiza el movimiento de la rata ni que se le permita moverse en frente del animal y que distraer. Permanezca en su lugar y reducir al mínimo su propio movimiento para que no afecten el comportamiento de la rata.
3. Continúa la recogida de muestras. Como durante la línea base, mover el tubo de salida a un tubo de recogida nuevo cada 5 min.
4. Alternancia pruebas. Deje que el animal de explorar libremente la laberinto durante 20 min. Registre la secuencia y el calendario de entradas en los brazos, ya sea usandouna grabación de vídeo o con la mano para un análisis posterior ejecución de la tarea ^9,15.

5. Post-prueba

1. Recolección de la muestra final. Después de la prueba, retire suavemente rata de laberinto y volver a controlar la cámara. Seguir recopilando microdiálisis muestra durante al menos cuatro muestras para cubrir el período de recuperación de la ejecución de tareas.
2. Sonda de eliminación. Después de que todas las muestras se han recogido, retire suavemente la sonda de la cabeza del animal y colocarlo en un frasco de almacenamiento; devolver el animal a su jaula.
3. Sonda de almacenamiento. Después de regresar animal a la jaula y completar cualquier colección de líquido de diálisis restante, enjuague la sonda cuidadosamente con dH ₂ 0 y guárdelo en un vial de centelleo lleno de dH ₂ 0 y cubierto con parafilm. Lavar la tubería por el cambio a una jeringa que contiene una solución de 1:10,000 Kathon en dH ₂ 0 para prevenir el crecimiento de microbios. Las sondas se pueden volver a utilizar, siempre que mantener un flujo y tienenningún daño a la membrana, con medidas de esta rutina debe ser de más de diez usos.
4. Histología. Matar el animal y retire el cerebro. Rebanada en un criostato y utilizar las técnicas histológicas estándar (por ejemplo, tinción de violeta de cresilo) para confirmar la colocación correcta de la sonda.

Resultados

Las ratas se recuperará rápidamente de la cirugía y estar alerta, móvil y activo dentro de los 30 min tras el cese de la anestesia. El impacto de la tapa de la cánula debe ser mínimo si la cirugía se lleva a cabo de manera limpia y cemento dental mínimo se utiliza. Si cualquier signo de infección se nota durante el seguimiento post-operatorio, o la rata es de ninguna manera mostrar signos de malestar o incomodidad, inmediatamente terminado el experimento, lo que debe ser extremadamente rara. Durante la tramitación antes...

Discusión

Todas las soluciones utilizadas en la microdiálisis se filtró inmediatamente antes de su uso, usando un filtro de 0,2 micras. Después de la inserción de la sonda dentro de la cánula guía, observar para confirmar que el flujo no está obstruido y recogida de muestras está ocurriendo. Si el flujo se detiene después de la inserción, la causa más probable es el daño a la membrana de la sonda causado por la insuficiente atención en la inserción, y una sonda fresco debe ser sustituido.

Como se seña...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			La mayoría de los reactivos son de grado de laboratorio estándar y se pueden obtener de un proveedor de elección. Del mismo modo, el equipo tal como bombas de jeringa y los tubos se puede utilizar desde cualquiera de varios fabricantes. Los temas específicos utilizados aquí para que los detalles son importantes incluyen:
CMA 12 sondas de microdiálisis	CMA / microdiálisis	CMA-12-XXX	Estos están disponibles en longitudes de membrana diferentes y cortes, indicados por códigos específicos en el 'XXX'.
La insulina humana (Humulina)	Eli Lilly	N / a
Giratorio líquido	Instech	375/D/22QM	Este giro específico tiene un par muy bajo y volumen interno, así como un nonrearevestimiento de cuarzo ctive.