Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Summary

Visualización de las células individuales en los tejidos densamente empaquetadas, tales como terminales de las células de Schwann (SC) en las uniones neuromusculares (NMJs), es un reto. "Sequential foto-blanqueamiento" permite delimitar SCs individuales terminal, por ejemplo en el explante de músculo triangularis esternón, una conveniente preparación nervio-músculo, donde secuencial de blanqueamiento puede ser combinado con las imágenes de lapso de tiempo y<em> Post-hoc</em> Immunostainings.

Abstract

Secuencial foto-blanqueador proporciona una manera no invasiva para etiquetar SCs individuales en la unión neuromuscular. El NMJ es el mayor sinapsis del sistema nervioso de los mamíferos y ha servido como guía modelo para estudiar la estructura y la función sináptica. En ratón terminales NMJs motor axón formar pretzel-como sitios de contacto con las fibras musculares. El axón motor y su terminal están rodeados por SCS. En las últimas décadas, varias ratones transgénicos se han generado para visualizar las neuronas motoras y SC, por ejemplo Thy1-XFP ¹ y Plp-GFP ratones ^2, respectivamente.

A lo largo de los axones motores, mielinizantes CSs axonales están dispuestas en que no se solapan entrenudos, separadas por nódulos de Ranvier, para habilitar la propagación saltatoria potencial de acción. En contraste, los CSs de terminales en la sinapsis son células gliales, que supervisar y promover la neurotransmisión, digerir los desechos y los axones de regeneración de guía. NMJs están bien tapado, hasta la mitad de una docena no myelginarios CSs terminales – estos, sin embargo, no puede ser resuelto individualmente por microscopía de luz, ya que están en contacto directo membrana ^3.

Existen varios enfoques para visualizar individualmente CSs terminales. Ninguno de estos es impecable, sin embargo. Por ejemplo, el relleno de tinte, donde las células individuales están empalado con un microelectrodo de tinte lleno, necesita destruir una célula marcada antes de llenar un segundo. Esto no es compatible con las posteriores grabaciones con lapso de tiempo ^3. Multiespectral "Brainbow" etiquetado de los CSs se ha logrado mediante el uso de la expresión combinatoria de proteínas fluorescentes ^4. Sin embargo, esta técnica requiere la combinación de varios transgenes y está limitada por el patrón de expresión de los promotores usados. En el futuro, la expresión de "foto-conmutables" proteínas en SC podría ser otra alternativa ^5. Aquí presentamos secuencial foto-blanqueador, en donde las células individuales son blanqueados, y su imagen obtenida por sustracción. Creemosque este enfoque – debido a su facilidad y versatilidad – representa una adición duradera a la tecnología de la paleta neurocientífico, especialmente en lo que puede ser utilizado in vivo y se transfiere a otros tipos celulares, sitios anatómicos o especies ^6.

En el siguiente protocolo, que detalle la aplicación secuencial de blanqueo y posterior confocal de lapso de tiempo microscopía a las SC terminales en explantes de músculo triangularis esternón. Esta delgada, superficial y se diseca fácilmente nervio-músculo preparación ^7,8 ha demostrado ser útil para el estudio de NMJ desarrollo, la fisiología y la patología ^9. Por último, se explica cómo el músculo triangularis esternón se prepara después de la fijación de realizar una correlación alta resolución de imagen confocal, inmunohistoquímica o exámenes ultraestructurales.

Protocol

1. Triangularis Sterni explante (Figura 1)

Tiempo: 15 min.

1. Preparar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de pinzas, 1 par de tijeras, 1 par de tijeras de primavera, un plato de cultivo de tejidos (10-cm). Pre-burbujeó (mínimo de 15 min) refrigerado (4 ° C) solución de Ringer con 5% de CO _2/95% O _2. Llena de 15 cm placa de cultivo de tejidos con hielo y se cubre con una placa de metal. Preparar microscopio de disección y colocar el plato 15-cm con hielo bajo el alcance de disección con el fin de enfriar el explante durante la disección.
2. Letalmente anestesiar el ratón por sobredosis isoflurano (o cualquier otro método aprobado de sacrificio). Pulverizar el ratón con 70% de etanol para evitar la contaminación de la piel explante. Por SC blanqueo, hemos utilizado Plp-GFP ratones, que se pueden cruzar para Thy1-OFP3 o Thy1 Membow13-para la visualización simultánea del axón.
3. Uso del par de tijeras de gran tamaño, hacer una incisión de línea media dela piel sobre el esternón y dos incisiones paralelas al borde inferior de la caja torácica.
4. Uso del par de tijeras de gran tamaño, retire la piel, abrir la pared abdominal, y hacer incisiones paralelas a la caja torácica todo el camino de vuelta a la columna vertebral. Después de disecar los músculos pectorales haciendo incisiones cerca de la inserción del músculo en el esternón.
5. Cortar el diafragma abierto justo debajo del cartílago xifoides y diseccionar fuera de la membrana a lo largo de sus inserciones costales.
6. Sosteniendo la caja torácica por el proceso xifoides con un conjunto de pinzas, comience a cortar las costillas de la columna vertebral, lo más cerca posible de sus inserciones. Los recortes izquierdo y derecho deben converger por encima del corazón hacia el manubrio del esternón. Trate de no cortar los principales vasos sanguíneos (especialmente las venas subclavias). Mejor visibilidad se logra levantando suavemente la preparación mientras se apoya en el apéndice xifoides con fórceps.
7. Haga un corte transversal justo por debajo del manubrio del esternóny transferir el explante en el plato 10-cm con CO ₂ al 5% enfriado / 95% O _2-burbujeó la solución de Ringer. Colocar el plato 10-cm en la placa de metal que cubre el plato de tejido 15-cm cultura lleno de hielo. Todos los pasos se deben hacer bajo el microscopio de disección.
8. Con unas tijeras pequeñas primavera eliminar los restos de timo, la pleura, el diafragma (el interior) y los músculos pectorales (externos; Figura 1B-D).
9. Para colocar el explante al plato de 3,5 cm, la disección de todas las costillas que no se insertan en el esternón. Esto se hace mejor usando unas tijeras pequeñas resorte y cortar el tejido entre las costillas (Figura 1E).
10. Pin el esternón triangularis músculo y el nervio explante en el Sylgard recubierto de 3,5 cm de placa de cultivo de tejidos utilizando pins minutien (abreviado a <4 mm; Figura 1G). Dos pasadores deben pasar por cartilaginosos (blanco) partes del esternón. Insertar al menos dos pasadores a través de los nervios, tanto en el lado izquierdo y derecho de thexplante e apuntando a las partes más blandas cartilaginosos y evitando las costillas por debajo o cerca del músculo triangularis. Los pasadores se utilizan más, mejor (usamos normalmente 8-10). A medida que precisar la preparación, asegúrese de que las costillas son algo extendido, se fija el músculo en una posición ligeramente estirado.
11. Opcional: visualizar los sitios sinápticos que contienen receptores de acetilcolina mediante la adición de bungarotoxina acoplados a colorantes Alexa (concentración de 0,8 g / ml en 5% de CO ₂ / O 95% de _2-burbujeó la solución de Ringer). Incubar explante clavada en el plato recubierto Sylgard durante 15-20 min a temperatura ambiente y luego se lava varias veces con 5% de CO _2/95% O _2-burbujear la solución de Ringer.

2. SC blanquear y opcional Time-lapse microscopía (Figura 2)

Tiempo: 30 – 45 min + opcional 1 – 5 horas por lapso de tiempo.

1. Transferencia de 3,5 cm Sylgard recubierto plato a un ingenio microscopio confocal equipadoh un láser de argón (488 nm de longitud de onda) y los objetivos de inmersión en agua (4x, 0,13 NA, 20x, 100x y NA 0,5, 1,0 NA o 60x, 0,9 NA).
2. Opcional para microscopía de lapso de tiempo: Insertar 3,5-cm Sylgard recubierto plato en anillo calefacción, instalar sistema de superfusión y sonda de temperatura (Figura 2A). Asegúrese de que ninguno de ellos toque el explante, el borde del plato o el recubrimiento Sylgard. Calentar la muestra a 33-35 ° C. Por SC blanqueo sin lapso de tiempo, la temperatura ambiente es mejor, ya que las células muestran menos dinámica entre las etapas de blanqueo.
3. Con el objetivo de 4x aire observar el patrón de inervación del músculo triangularis esternón y encontrar banda triangularis placa terminal esternón. Cambiar a 20x de inmersión de cono objetivo y empezar a buscar regiones superficiales dentro de la banda placa terminal (costillas áreas superpuestas son buenos candidatos). Cambio de objetivo 60x a 100x o inmersión de cono objetivo de comprobar en NMJs individuales. Ideal es un NMJ que está cubierta por SCS varios y se encuentra muy superficially (Figura 2B). Si se realiza una vez-lapse de imágenes después del blanqueo, seleccione hasta 3 NMJs que están relativamente cerca entre sí para aumentar el rendimiento.
4. Adquirir una imagen confocal de la UNM antes de foto-blanqueamiento SCs individuales (Figura 2B). (Para obtener imágenes de resolución completa, por ejemplo en un microscopio Olympus FV1000, utilizar un 100x, 1,0 NA objetivo zoom y 2,5, lo que resulta en Nyquist-limitado muestreo de ~ 0,1 m por píxel.)
5. "Park" el haz de láser 488 nm de forma centralizada en el núcleo de un SC utilizando la máxima potencia durante 5 segundos (alternativamente un patrón de exploración eficaz en una pequeña región de interés puede ser utilizado, tal como el "tornado scan" función en un microscopio Olympus; como se utiliza un microscopio confocal, el láser se centró en los planos conjugados de imagen y, por tanto, a 488 nm con un objetivo de 1,0 NA, <0,5 m de diámetro). Vuelva a centrarse en la célula y juez blanqueo resultado. Si es necesario, repita el paso blanqueo de nuevo hasta que los niveles de GFP son reducird hasta niveles cercanos a fondo. Adquirir una imagen después de la decoloración (Figura 2C). Es importante asegurarse de que la región blanqueada está fuera de cualquier superposición entre dos células – Si hay una superposición, el blanqueado en una segunda celda será obvio.
6. Repetir el paso anterior hasta que todos menos uno SC se blanquean (Figura 2D-E). El último "blanquear" SC es adecuado para confocal time-lapse microscopía. Reconstruir las células individuales por sustracción de imágenes, por ejemplo, utilizando software Photoshop, para delinear sola morfología SC y territorio (Figura 2F). Tenga en cuenta que restar dos magos añade ruido (por ejemplo, mediante la importación de ellos consecutivos en "capas" en Photoshop, y luego poner el canal superior a la "diferencia" en el menú desplegable en la parte superior de la pestaña de canales). Esto puede ser evitado mediante la opción "Limpiar" la función de los canales antes de la resta y recortar a la basura cualquier fondo que, obviamente, no se origina en lacélula blanqueada. Para optimizar el contraste, puede ser necesario ajustar el brillo de los dos canales en el "nivel" de la ventana. La imagen resultante de la célula blanqueada es el superpuesta a la imagen original de una sinapsis, pseudo-coloreado en un color único y transparente para colorear el territorio de la célula blanqueada en la imagen original (de hacer esto para todos blanqueada y el último , las células sin blanquear la imagen mostrada en la Figura resultados 2F).
7. Opcional: Inicio confocal time-lapse microscopía después del blanqueamiento todos menos un SC. Tome una imagen a intervalos fijos (por ejemplo cada 5 min a 10). Uso como potencia de láser poco como sea posible. Hasta 3 NMJs pueden ser reflejados en la misma sesión.
8. Hacer un mapa de los NMJs tiempo transcurrido tomando una imagen a 100x sin zoom, a continuación, imágenes de la región con los objetivos de 20x y 4x (Figura 2G-I). Este "mapa" es necesaria para encontrar NMJs siguientes inmunohistoquímica de un músculo determinado.
9. Para la imagenprocesamiento, convertir imágenes individuales en las proyecciones de máxima intensidad y guardar en formato tiff. Combine todos los z-proyectados puntos temporales en una pila y alinear en xy, por ejemplo, a través del "stackreg" plugin ¹⁰ en Fiji (un paquete basado en el código abierto de software ImageJ, National Institutes of Health).

3. La fijación y la inmunohistoquímica (Figura 3)

Tiempo: Noche.

1. Transferir el explante en un tubo de reacción de 50-ml que contiene al menos 15 ml de 4% de PFA retirando cuidadosamente los pins. Enviar a fijar la pared torácica anterior que contiene el músculo triangularis esternón durante 1 hora en hielo. Enjuague tejido fijado con glicina 0,1 M en PBS (para apagar fijador residual y por lo tanto reducir el fondo) durante al menos 10 min. Las muestras se pueden almacenar en este punto y procesados ​​posteriormente.
2. Transferir explante fija a una placa de 10-cm Sylgard cultivo de tejidos recubierto lleno con 0,01 M PBS. Cortar una forma trapezoidal con un siparalelo de hasta el esternón y el otro a través de las transiciones hueso-cartílago – contiene el músculo triangularis en su superficie. Retire las costillas inferiores con una horizontal (es decir, trans-esternal) cortado de modo que el extremo caudal del músculo triangularis puede ser visitado libremente (Figura 3A-D).
3. Insertar una aguja hipodérmica como un pasador en la parte superior del trapezoide (Figura 3E). El uso de una aguja hipodérmica unida a una jeringa de 1 ml y fórceps para extraer el músculo triangularis en la superficie suavemente sosteniendo en una esquina caudal del músculo y utilizando la aguja como un micro-bisturí. Asegúrese de que los cortes se realizan en paralelo al plano de la pared torácica. Una vez que la parte caudal del músculo se libera, insertar otra aguja hipodérmica como un pasador debajo del músculo a través de la pared torácica – esto inmoviliza la preparación y permite ejercer una tracción suave sobre el músculo usando fórceps (Figura 3F). A medida que se corte TISS conectivoinserciones ue, "piel" de distancia del músculo del tórax. Cortar apego caudal pasado con tijeras de primavera. Retire los restos de grasa y los vasos de sangre utilizando fórceps. Tenga cuidado de no rasgar lejos de los nervios Nota:. Utilice conjuntos separados de las herramientas y los platos para trabajar con tejido vivo y fijos.
4. Iniciar la inmunohistoquímica (usando un protocolo estándar) mediante la transferencia de muestras de tejido en solución de bloqueo durante 1 hora en un agitador a temperatura ambiente. Volumen más pequeño posible para la tinción es de 200 l usando una placa de 96 pocillos.
5. Aplicar el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo, 200 l por pocillo, durante la noche a 4 ° C en un agitador.
6. Lavar en 0,01 M PBS tres veces durante 10 min.
7. Aplicar el anticuerpo secundario adecuado para 1-2 horas a temperatura ambiente se diluyó en solución de bloqueo.
8. Lavar en 0,01 M PBS tres veces durante 10 min.
9. Montar en anti-fading medio (por ejemplo Vectashield) y cubreobjetos.
10. Colocar el portaobjetos en la placa de metal magnético, imán lugar en la parte superiorde la muestra para aplanar durante unas pocas horas o durante la noche a 4 ° C. Selle con esmalte de uñas.

Representative Results

Discussion

El método de blanqueo SC presentado aquí es sencillo, rápido y versátil: (i) Se permite revelar única morfología SC y dinámica por microscopía confocal basado en un único transgén – lo cual es una ventaja significativa cuando se combina con el enfoque por ejemplo, modelos de enfermedades que requieren alelos adicionales . (Ii) El método es rápido, a partir de la disección para la fijación se puede realizar en un medio día. (Iii) El número de aplicaciones es muy amplio, ya que puede ser combinado con otros métodos, tales como procedimientos de ablación de células, orgánulos de formación de imágenes, la electrofisiología o inmunohistoquímica. Además, el enfoque que aquí se presenta para SCS en NMJs murinos se pueden generalizar a otras células, tejidos o especies – un ejemplo de una aplicación de una técnica relacionada en el pez cebra se presenta en la referencia 6. También otras proteínas fluorescentes, además de GFP se puede utilizar para blanquear y microscopía tiempo transcurrido, por ejemplo YFP o PPC. Si bien no hemos utilizado estas proteínas fluorescentes en SC, bleaching de axones muestra que una proteína fluorescente menos estable (por ejemplo, CFP) en esta configuración puede ser ventajosa. Sin embargo, un compromiso entre la formación de imágenes eficaz de blanqueo y estable tiene que ser encontrado, dependiendo de los resultados deseados (por ejemplo, imagen individual frente al lapso de tiempo de los restantes sin blanqueados células).

Hay una serie de limitaciones a la técnica, sin embargo. Uno se refiere al uso de un explantado (y por lo tanto axotomizado) músculo, lo que limita el período de formación de imágenes. En estudios previos se ha encontrado que – dependiendo de la pregunta en estudio – la triangularis explante esternón se puede utilizar para un máximo de 3-6 horas. Sin embargo, secuencial foto-blanqueador se puede utilizar in vivo, superar esta limitación siempre que la muestra puede ser suficientemente estabilizado para obtener imágenes que se pueden restar. Hay otros dos aspectos deben tenerse en cuenta, al analizar los datos resultantes del enfoque secuencial blanqueo: (i) La fototoxicidad podría alterar dinamismo SC, como kIlling se produce una terminal de SC en la rápida expansión de sus vecinos ^11. Así controles de verosimilitud se debe incluir, por ejemplo, la medición de la cantidad de expansiones y retracciones en una sinapsis estable. Por término medio, la población de las SC con imagen no significativamente debería aumentar o disminuir. (Ii) La morfología de todos excepto el último SC se obtiene por sustracción de imágenes. La calidad de este tipo de la imagen depende del contraste obtenido blanqueo. Esto se consigue generalmente más fácil en las líneas de ratón brillantes. Por ejemplo, Plp-GFP funciona mejor que S100-GFP ^12. Sustracción de imágenes añade ruido, por lo que los CSs últimos se obtiene por lo general con más detalle que los otros (especialmente también, como post-hoc de formación de imágenes después de la fijación permite el uso de altos objetivos numéricos de aceite de abertura). Por lo tanto, una característica morfológica sólo debe ser aceptado como verdadero, si es visible en los "últimos" SCS, así como en las blanqueadas.

Materials

70% (vol/vol) ethanol solution	Roth	T913.1	in spray bottle
isoflurane	Forene, Abbott		any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia
transgenic mice (<em>Plp</em>-GFP)			to be obtained from cited sources
dissection microscope with cold-light illumination	Olympus SZ51		equipped with Schott KL 1500 LCD
forceps #2	Fine Science Tools	11233-20
forceps #5	Fine Science Tools	11295-00
scissors, large medical	Fine Science Tools	14108-09
scissors, small angled spring	Fine Science Tools	15033-09
in-line heater	Warner Instruments	SF-28
heating ring for 3.5-cm dishes	Warner Instruments	64-0110 DH-35
two channel temperature control system	Warner Instruments	TC-344B
superfusion pump system			custom-built
15-cm tissue culture dish	Sarstedt	83.1803.003	filled with ice and covered by metal plate
10-cm tissue culture dish	Sarstedt	83.1802.003	with oxygenated Ringer's solution
3.5-cm tissue culture dish	Sarstedt	83.1800.003	filled with Sylgard polymer
Sylgard polymer	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
confocal microscope	Olympus	FV1000	with argon laser
50-ml reaction tube	Sarstedt	62.547.254 PP
4% PFA in PBS	Sigma	P6148
cannula 0.5 mm x 25 mm	Neolab	E-1510
syringe 1 ml	Neolab	E-1496
synaptophysin antibody	Invitrogen	18-0130	rabbit
secondary antibody	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
24-well plate	Sarstedt	83.1836
0.01 M PBS	Sigma	P4417
0.1 M glycine in PBS	Roth	3790.1
coverslips	Neolab	E-4132
slides	Neolab	E-4121
Vectashield	Vector labs	H-1000
minutien pins ×10	Fine Science Tools	26002-20	shortened to &lt; 4 mm
&alpha;-Bungarotoxin coupled to Alexa 594	Invitrogen (Molecular Probes)	B-13423
<em>Blocking Solution</em>
0.01 M PBS
0.2% Triton-X100	Roth	3051.3
10% Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
1% bovine serum albumin	Sigma	A7030
<em>Ringer<br/> </em>bubbled with 95% O<sub>2</sub> /5% CO<sub>2</sub>
125 mM NaCl	Sigma	S7653
2.5 mM KCl	Sigma	P9333
1.25 mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Sigma	S8282
26 mM NaHCO<sub>3</sub>	Sigma	S6297
2 mM CaCl<sub>2</sub>	Sigma	21114
1 mM MgCl<sub>2</sub>	Sigma	63020
20 mM glucose	Sigma	G7528
<p class="jove_content"><strong>Table 1.</strong> Specific reagents and equipments.</p>