Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Resumen

Visualización de las células individuales en los tejidos densamente empaquetadas, tales como terminales de las células de Schwann (SC) en las uniones neuromusculares (NMJs), es un reto. "Sequential foto-blanqueamiento" permite delimitar SCs individuales terminal, por ejemplo en el explante de músculo triangularis esternón, una conveniente preparación nervio-músculo, donde secuencial de blanqueamiento puede ser combinado con las imágenes de lapso de tiempo y Post-hoc Immunostainings.

Resumen

Secuencial foto-blanqueador proporciona una manera no invasiva para etiquetar SCs individuales en la unión neuromuscular. El NMJ es el mayor sinapsis del sistema nervioso de los mamíferos y ha servido como guía modelo para estudiar la estructura y la función sináptica. En ratón terminales NMJs motor axón formar pretzel-como sitios de contacto con las fibras musculares. El axón motor y su terminal están rodeados por SCS. En las últimas décadas, varias ratones transgénicos se han generado para visualizar las neuronas motoras y SC, por ejemplo Thy1-XFP ¹ y Plp-GFP ratones ^2, respectivamente.

A lo largo de los axones motores, mielinizantes CSs axonales están dispuestas en que no se solapan entrenudos, separadas por nódulos de Ranvier, para habilitar la propagación saltatoria potencial de acción. En contraste, los CSs de terminales en la sinapsis son células gliales, que supervisar y promover la neurotransmisión, digerir los desechos y los axones de regeneración de guía. NMJs están bien tapado, hasta la mitad de una docena no myelginarios CSs terminales - estos, sin embargo, no puede ser resuelto individualmente por microscopía de luz, ya que están en contacto directo membrana ^3.

Existen varios enfoques para visualizar individualmente CSs terminales. Ninguno de estos es impecable, sin embargo. Por ejemplo, el relleno de tinte, donde las células individuales están empalado con un microelectrodo de tinte lleno, necesita destruir una célula marcada antes de llenar un segundo. Esto no es compatible con las posteriores grabaciones con lapso de tiempo ^3. Multiespectral "Brainbow" etiquetado de los CSs se ha logrado mediante el uso de la expresión combinatoria de proteínas fluorescentes ^4. Sin embargo, esta técnica requiere la combinación de varios transgenes y está limitada por el patrón de expresión de los promotores usados. En el futuro, la expresión de "foto-conmutables" proteínas en SC podría ser otra alternativa ^5. Aquí presentamos secuencial foto-blanqueador, en donde las células individuales son blanqueados, y su imagen obtenida por sustracción. Creemosque este enfoque - debido a su facilidad y versatilidad - representa una adición duradera a la tecnología de la paleta neurocientífico, especialmente en lo que puede ser utilizado in vivo y se transfiere a otros tipos celulares, sitios anatómicos o especies ^6.

En el siguiente protocolo, que detalle la aplicación secuencial de blanqueo y posterior confocal de lapso de tiempo microscopía a las SC terminales en explantes de músculo triangularis esternón. Esta delgada, superficial y se diseca fácilmente nervio-músculo preparación ^7,8 ha demostrado ser útil para el estudio de NMJ desarrollo, la fisiología y la patología ^9. Por último, se explica cómo el músculo triangularis esternón se prepara después de la fijación de realizar una correlación alta resolución de imagen confocal, inmunohistoquímica o exámenes ultraestructurales.

Protocolo

1. Triangularis Sterni explante (Figura 1)

Tiempo: 15 min.

1. Preparar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de pinzas, 1 par de tijeras, 1 par de tijeras de primavera, un plato de cultivo de tejidos (10-cm). Pre-burbujeó (mínimo de 15 min) refrigerado (4 ° C) solución de Ringer con 5% de CO _2/95% O _2. Llena de 15 cm placa de cultivo de tejidos con hielo y se cubre con una placa de metal. Preparar microscopio de disección y colocar el plato 15-cm con hielo bajo el alcance de disección con el fin de enfriar el explante durante la disección.
2. Letalmente anestesiar el ratón por sobredosis i....

Resultados

Un ejemplo de un explante triangularis esternón plato listo para formación de imágenes se muestra en la Figura 1G. Este explante es particularmente adecuado para formación de imágenes NMJs ex vivo como el músculo triangularis consiste sólo en unas pocas capas de fibras musculares. Esto permite la obtención de imágenes de alta resolución a partir de explantes derivados de líneas de ratones transgénicos que seleccione ya sea SCS (Plp-GFP ²⁾ y / o axones (Thy1-XFP

Discusión

El método de blanqueo SC presentado aquí es sencillo, rápido y versátil: (i) Se permite revelar única morfología SC y dinámica por microscopía confocal basado en un único transgén - lo cual es una ventaja significativa cuando se combina con el enfoque por ejemplo, modelos de enfermedades que requieren alelos adicionales . (Ii) El método es rápido, a partir de la disección para la fijación se puede realizar en un medio día. (Iii) El número de aplicaciones es muy amplio, ya que puede ser combinado con otros métod.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Company (ejemplo)	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Etanol 70% (vol / vol) de solución	Roth	T913.1	en botella de spray
isoflurano	Forene, Abbott		cualquier otro anestésico aprobado puede ser utilizado para la anestesia letal
ratones transgénicos (PLP-GFP)			para obtener de fuentes citadas
disección con microscopio de luz fría iluminación	Olympus SZ51		equipado con Schott KL 1500 LCD
fórceps #2	Herramientas Artes Ciencias	11233-20
fórceps # 5	Herramientas Artes Ciencias	11295-00
tijeras, grandes médicos	Herramientas Artes Ciencias	14108-09
tijeras, primavera ángulo pequeño	Herramientas Artes Ciencias	15033-09
en línea calentador	Warner Instruments	SF-28
calentar el anillo para los platos de 3,5 cm	Warner Instruments	64-0110 DH-35
dos temperaturas canal de control del sistema	Warner Instruments	TC-344B
sistema de bomba de superfusión			hecha a la medida
15-cm placa de cultivo de tejidos	Sarstedt	83.1803.003	lleno de hielo y cubierta por placa de metal
10-cm placa de cultivo de tejido	Sarstedt	83.1802.003	con solución de Ringer oxigenada de
3,5 cm de placa de cultivo de tejido	Sarstedt	83.1800.003	lleno de Sylgard polímero
Sylgard polímero	Dow Corning	Sylgard 184 Elastómero de silicona Kit
microscopio confocal	Olimpo	FV1000	con láser de argón
50-ml tubo de reacción	Sarstedt	62.547.254 PP
PFA al 4% en PBS	Sigma	P6148
cánula de 0,5 mm x 25 mm	Neolab	E-1510
jeringa de 1 ml	Neolab	E-1496
sinaptofisina anticuerpo	Invitrogen	18-0130	conejo
anticuerpo secundario	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
24-así placa	Sarstedt	83,1836
0,01 M PBS	Sigma	P4417
0,1 M de glicina en PBS	Roth	3790.1
cubreobjetos	Neolab	E-4132
diapositivas	Neolab	E-4121
Vectashield	Vector laboratorios	H-1000
minutien pins × 10	Herramientas Artes Ciencias	26002-20	acortado a <4 mm
α-Bungarotoxina acoplada a Alexa 594	Invitrogen (Molecular Probes)	B-13423
			Solución de bloqueo
0.01 M PBS
0,2% de Triton-X100	Roth	3051.3
10% suero normal de cabra	Abcam	ab7481
1% albúmina de suero bovino	Sigma	A7030
			Campanero burbujeaba con 95% O 2/5% CO 2
125 mM NaCl	Sigma	S7653
2,5 mM KCl	Sigma	P9333
1,25 mM NaH 2 PO 4	Sigma	S8282
26 mM NaHCO 3	Sigma	S6297
2 mM CaCl 2	Sigma	21114
1 mM MgCl 2	Sigma	63020
20 mM de glucosa	Sigma	G7528
			Tabla 1. Reactivos y equipos específicos.