Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

Resumen

Las células T que expresan un receptor CD19 específico de antígeno quimérico (CAR) se infunden como tratamiento de investigación de células B malignas en nuestros primero en humanos ensayos de terapia génica. Se describe la modificación genética de las células T utilizando el La Bella Durmiente (SB) sistema para introducir CD19-CAR específico y selectivo en la propagación diseñador CD19 + células presentadoras de antígeno artificiales.

Resumen

La potencia de grado clínico células T se puede mejorar mediante la combinación de la terapia génica con inmunoterapia para diseñar un producto biológico con potencial para la superior (i) el reconocimiento de antígenos asociados a tumores (TAA), (ii) la persistencia después de la infusión, (iii) potencial para la migración a los sitios tumorales, y (iv) la capacidad para reciclar funciones efectoras en el microambiente tumoral. La mayoría de los enfoques para la manipulación genética de las células T diseñadas para aplicación en seres humanos han utilizado retrovirus y lentivirus para la expresión estable de CAR ^1-3. Este enfoque, aunque compatible con la práctica actual de fabricación (NCF), puede ser costoso ya que se basa en la fabricación y liberación de grado clínico virus recombinante a partir de un número limitado de instalaciones de producción. La transferencia electro-de plásmidos no virales es una alternativa atractiva a la transducción desde especies de ADN puede ser producido a grado clínico a aproximadamente ^1/10 de los costes de recombinhormiga GMP-grado virus. Para mejorar la eficiencia de la integración nos adaptamos Bella Durmiente (SB) transposón y transposasa humano para ^4-8 aplicaciones. Nuestro sistema SB utiliza dos plásmidos de ADN que constan de un transposón que codifica para un gen de interés (por ejemplo, 2 ^ª generación CD19 específico de transgén CAR, designado CD19RCD28) y una transposasa (por ejemplo SB11) que se inserta el transgén en dinucleótido TA repite ^9-11 . Para generar números clínicamente suficiente de células T modificadas genéticamente que utilizamos K562-derivados de las células presentadoras de antígeno artificiales (AAPC) (clon n º 4) modificadas para expresar un TAA (por ejemplo, CD19), así como las moléculas coestimuladoras de células T CD86, CD137L, una unida a la membrana versión de la interleucina (IL) -15 (péptido fusionado a modified IgG4 región Fc) y CD64 (Fc-γ receptor 1) para la carga de anticuerpos monoclonales (mAb) ^12. En este informe, demuestran los procedimientos que se pueden realizar en compliance con cGMP para generar CD19 específico CAR ⁺ células T adecuadas para aplicación humana. Esto se logró mediante la síncrono electro-transferencia de dos plásmidos de ADN, un transposón SB (CD19RCD28) y una transposasa SB (SB11), seguido por la recuperación de los integrantes estables por las adiciones cada-7-días (ciclo de estimulación) de γ-irradiado AAPC (clon n º 4) en presencia de IL-2 soluble recombinante humano y ¹³ IL-21. Típicamente 4 ciclos (28 días de cultivo continuo) se llevan a cabo para generar números clínicamente atractivas de las células T que expresan de manera estable el CAR. Esta metodología para la fabricación de grado clínico CD19 específico de células T se pueden aplicar a las células T derivadas de sangre periférica (PB) o sangre de cordón umbilical (UCB). Por otra parte, este enfoque puede ser aprovechada para generar células T a diversos tipos de tumores por el emparejamiento de la especificidad de la CAR introdujo con la expresión de la TAA, reconocida por la CAR, en la AAPC.

Protocolo

Día 0 o antes

1. Aislamiento de células mononucleares (MNC) de PB y UCB

1. Diluir PB con igual volumen, y UCB con cuatro volúmenes de PBS-EDTA.
2. Lentamente capa diluida de sangre (25 ml) sobre Ficoll (12 ml) en un tubo de centrífuga de 50 ml (s) y se centrifuga a 400 xg durante 30 - 40 min (sin freno).
3. Recoger y transferir la fracción de células mononucleares (interfaz) usando una pipeta de transferencia a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml.
4. Llevar el volumen hasta 50 ml con PBS-EDTA y se centrifuga a 450 xg durante 10 min.
5. Aspirar el sobrenadante, resuspender suavemente el sedimento celular (s) en 50 ml de medio de cultivo completo (CCM) y, centrifugar a 400 xg durante 10 min.
6. Suavemente resuspender piscina y los sedimentos celulares en CCM y llevar a cabo un recuento de células mediante el método de exclusión con azul de tripano (Cellometer, programa CMSP).
7. MNC se puede utilizar ahora para la electroporación (nucleofection) o criopreservados para su uso futuro.

título "2>. Preparación de las células T para la electroporación en el Día 0

1. Si se utiliza criopreservados MNC, descongelar rápidamente un número suficiente de células para electroporación escala completa (2 x 10 ⁸ añadiendo ~ 20% para tener en cuenta la pérdida de células durante la centrifugación y 2 horas de incubación) en 37 ° C baño de agua. Si se utiliza recién aisladas MNC vaya al paso 2.3.
2. Volver a suspender suavemente y transferir las células a un tubo de centrífuga de tamaño apropiado (s) contenida pre-calentado completa de fenol RPMI libre de medio de cultivo (RPMI-PF) y se centrifuga a 200 xg durante 10 min (sin freno), el sobrenadante aspirado.
3. Se resuspende el MNC en RPMI-PF, realizar un recuento de células (Cellometer) y transferir las células a un recipiente de cultivo de células de tamaño apropiado (s) a una concentración de 10 ⁶ células / ml.
4. Incubar en un humidificado 37 ° C / 5% de CO ₂ incubadora durante 2 h ± 30 min.
5. Transferir el MNC para tubo de centrífuga estéril (s), centrifugado a 200 xg durante 5 min (sin frenos), aspirar el sobrenadante y suavemente re-suspender y combinar el sedimento celular (s) en el PF-RPMI.
6. Realizar un recuento de células (Cellometer) y calcular el volumen de la suspensión celular requerida (2 x 10 ⁸ MNC).
7. Transferir el volumen calculado a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml y centrifugar a 200 xg durante 10 min (sin freno).
8. Aspirar el sobrenadante de manera que no queden residuos de medios de comunicación y resuspender suavemente tocando el lado del tubo.

3. Electroporación (nucleofection) de MNC (proceso a escala completa mediante cubetas de 10) en el Día 0

1. Preincubar un estéril 12-así placa con 10 pocillos que contenían 4 ml de RPMI-PF caliente en un humidificado 37 ° C / 5% de CO ₂ incubadora.
2. Preparar y pre-caliente el Lonza Solución Nucleofector Human T kit celular (reconstituido según las instrucciones del fabricante, www.lonza.com ) a temperatura ambiente en un gabinete de bioseguridad (BSC).
3. Preparar la solución Nucleofector / mezcla maestra de ADN por adding 100 l de solución de Nucleofector suplementado, 15 g de transposón (ADN superenrollado plásmido designado como CD19RCD28/pSBSO) y 5 g de transposasa (ADN superenrollado plásmido designado como pCMV-SB11) por reacción / cubeta.
4. Dispersar el sedimento celular (del paso 2,8) golpeando suavemente el lateral del tubo de centrífuga y volver a suspender en solución de mezcla maestra nucleofection / ADN (concentración final de células: 2 x 10 ⁷ células/100 l).
5. Transfiera cuidadosamente 100 l de la suspensión celular (del paso 3,4) a cada uno de diez (10) cubetas nucleofection Lonza, teniendo cuidado de evitar burbujas.
6. Pulse la cubeta una vez, y electroporar utilizando el programa U-014 (para las células T no estimuladas).
7. Transferir las cubetas y la placa de 12-pocillos (Paso 3,1) a la BSC.
8. Recoger las células electroporadas de cada cubeta utilizando un Amaxa fina punta de pipeta de transferencia, mediante la adición de ~ 500 l de medio de cultivo pre-calentado desde el pocillo correspondiente (12-así placa preparado en Step 3,1) y devolver la placa a un humidificado 37 ° C / 5% de CO ₂ incubadora durante 2 h ± 30 min.
9. Después de la 2-hr de incubación, la cosecha y transferir las células de todos los pocillos a un tubo de centrífuga estéril.
10. Lavar las células por centrifugación a 140 xg durante 8 min, temperatura ambiente, sin freno y aspirar y descartar el sobrenadante de modo que no hay ningún medio residual cubre el sedimento celular.
11. Dispersar el sedimento celular por golpeando suavemente el lateral del tubo de centrífuga y volver a suspender suavemente en CCM para lograr una única suspensión celular.
12. Realizar el recuento de células y ajustar la concentración celular a 10 ⁶ células / ml en CCM.
13. Transferir la suspensión celular a un matraz de cultivo celular (s) y lugar en la incubadora durante la noche.
14. Las etapas del proceso desde 2,1 hasta 3,8 se repitieron para el control de: EGFP transfectadas las células (5 x 10 ⁶ células / cubeta con 5 g Amaxa de control EGFP plásmido superenrollado, pmaxGFP).

Día 1 de ¹ ° y subsiguientesCiclos de estimulación

4. Análisis de la expresión CAR por citometría de flujo en el día 1

1. Recoger las células electroporadas y realizar un recuento de células utilizando Trypan método de exclusión de azul (hemocitómetro).
2. Células de tinción (1 a 2 x 10 ⁶⁾ con anticuerpo específico para CD3, CD4, CD8, y humano IgG Fc gamma (como una medición de la expresión de CAR).
3. Adquirir las células en FACS Calibur y analizar los datos utilizando FCS software Express para calcular la expresión de CAR.
   1. Calcular las células Coche ⁺ en cultivo mediante la fórmula:
      (Número de células viables totales) x (CAR% ⁺ células) = No. de CAR ⁺ células

5. Preparación de AAPC (clon n º 4) en el Día 1. AAPC (clon # 4) se obtuvieron a partir de células K562 (línea parental Obtenidos a partir de American Type Culture Collection) para Co-express Deseado células T co-estimuladoras molécula

1. Descongelar una alícuota de congelados 100 AAPC Gy irradiados en un 37 °; C baño de agua.
2. Las células se lavaron dos veces por centrifugación a 400 xg, 10 min en CCM y se contaron utilizando Cellometer (exclusión de azul de tripano).
3. Calcular el número de AAPC viable necesario para la estimulación:
   (No. de CAR ⁺ células) x 2 = Número de la AAPC irradiado requiere

6. AAPC mediada por la estimulación de las células T CAR ⁺ 1 que comienza el día de 1 ^º y subsiguientes ciclos de estimulación

1. Mezclar las células electroporadas (que expresan CAR) y γ-irradiado AAPC (clon n º 4) en un recipiente estéril en una proporción de 1:2 (CAR ⁺ celular: viable AAPC) en CCM.
   1. Tenga en cuenta la relación de AAPC se ajusta para la expresión de CAR basado en citometría de flujo el día después de la electroporación.
2. Añadir IL-21 (30 ng / ml) a la suspensión celular.
3. Dividir en partes alícuotas en T-75 cm ² frasco (s) y / o bolsas de Vue Cultura Vida en una concentración de 10 ⁶ células / ml y volver a la incuo.

Días 3, 5

7. Cultura Continuación de CAR ⁺ células T

1. Realizar un cambio de medio de comunicación, reponer IL-21, y mantener las células T en una concentración de 10 ⁶ células / ml.

Día 7

8. Fin del primer ciclo de estimulación mediada por AAPC

1. Cosecha de células, contar y mancha para CD3, CD4, CD8 y Fc gamma (CAR) y vaya al paso 10.1.

9. El agotamiento de las células CD56 ⁺ (normalmente entre 7 y 14 días después de la electroporación)

1. Realizar un agotamiento CD56 usando perlas paramagnéticas si CD56 + CD3 ^neg linfocitos ≥ 10%.

Ciclos de estimulación # 2, # 3 y # 4, correspondientes a los días 8 → 14 → 15 días, 21 días, y 22 → 28

10. La adición recursiva de AAPC para propagar las células T a los Números de vista clínico-suficientes

1. Repita el stimulatioproceso de n (4 veces) como se describe en los pasos 4.3-8.1.
2. Añadir IL-2 (50U/ml) a los cultivos que comienzan en los días 7, 14 y 21, y después de cada cambio de medio (tres veces por semana, en un horario de lunes, miércoles y viernes).
3. Criopreservar (archivo) las células T en exceso como sea necesario.
   1. Células T congelada utilizando congelador de velocidad controlada.

Día 28

11. Fin del último ciclo de estimulación mediada por AAPC: Las células T Cosecha

1. Criopreservar las células T para la aprobación e infusión.

Resultados

Se reporta que la electro-transferencia de plásmidos de ADN y la propagación de las células T en γ-irradiado AAPC se puede utilizar para generar números clínicamente atractivas de las células T derivadas de PB y UCB para aplicaciones humanas. Estas células modificadas genéticamente T expresan un CAR introducido que reconoce el TAA CD19, independiente del complejo mayor de histocompatibilidad. Los plásmidos de ADN SB-derivados de expresar el transposón (i), un coche de 2 ^ª generación (CD19RCD28) que señales a través de CD28 y CD3-ε ^14, y (ii) de la transposasa, SB11 ^15, se han descrito previamente ^{13, 16,17} . Los plásmidos utilizados en este estudio fueron producidos comercialmente, por servicio Waisman biofabricación Clínica (Madison, WI). La AAPC (clon n º 4), derivado de células K562 (línea parental obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo), co-expresar deseados moléculas coestimuladoras de células T-(cada molécula introducida en ³ 90% en la superficie celular de AAPC),como se ha descrito previamente ^12. Aquí nos muestran que CD19 específicos de las células T podrían ser generados a partir de células mononucleares (MNC) derivados de PB o UCB utilizando transposición SB para introducir el coche seguido de la adición de AAPC numéricamente para expandir las células T en una manera dependiente del automóvil (Figuras 1 , 4) ^13,18. Diez cubetas (2x10 ⁷ MNC / cubeta) se someten a electroporación para cada destinatario utilizando 15 mg de ADN plásmido (CD19RCD28/pSBSO) de codificación para transposón (CAR) y 5 g de ADN plásmido (pCMV-SB11) que codifica para la transposasa (SB11). El número de cubetas se puede reducir si MNC están limitando o reducido para el trabajo de laboratorio. El día de la electroporación se define como "0" Día del ciclo de estimulación # 1. Como controles para citometría de flujo y las condiciones de cultivo, células T autólogas son Mock electroporada (sin ADN plásmido) y numéricamente expandido en γ-irradiado AAPC (clon n º 4) que había sido pre-cargado con OKT3 para reticular CD3 para sostener las células T proliferación. Nos routinely evaluar la eficiencia de electrotransferencia y la viabilidad de las células T el día después de la electroporación (Figura 2B). La expresión de EGFP a partir de ADN plásmido de control (designado pmaxGFP) y CAR en este punto temporal inicial refleja la expresión de proteínas a partir del plásmido integrado y episomal. Típicamente, el día después de la electroporación se mide la expresión de EGFP en ~ 60% y la expresión de CAR en ~ 40% (Figura 2A) con la viabilidad de células T entre 40-50%. Adiciones recursivas de γ-irradiado AAPC en presencia de IL-2 soluble recombinante humana y de IL 21-recuperar las células T que expresan establemente CAR (CD19RCD28). CD3 ^neg CD56 ⁺ células NK se agotan a partir del cultivo utilizando CD56-específicos perlas paramagnéticas si el porcentaje de estas células NK es ≥ 10% y especialmente si el porcentaje de CAR se expresa en las células T es baja. Este agotamiento rápido evita el crecimiento excesivo de las células NK, que interfiere con la capacidad de AAPC para sostener la proliferation de CAR ⁺ T cells. En ocasiones, el agotamiento de células NK de CAR ⁺ células T se lleva a cabo durante los ciclos de estimulación dos últimos, pero esto introduce una pérdida de células deseadas debido a la co-expresión de CD56 en algunos CAR ⁺ células T. Las células T se cultivaron en un sistema funcionalmente cerrado usando Vue bolsas de cultivo Vida pasado día 14. Un subconjunto de las células genéticamente modificadas y reproducidas T son típicamente criopreservado en día 14 o el día 21 (fin de los ciclos de estimulación # 2 o # 3) de co-cultivo en AAPC para servir como una fuente de material archivado para futuros análisis y para ser descongelados si los problemas no anticipados posteriormente se producen durante el proceso de fabricación. Las células T se recogen típicamente en o alrededor del día 28 de cultivo (Figura 3) que habitualmente expresan CAR> 90% y son> 80% viable (figura 2c, d). Anteriormente hemos demostrado que, después de cuatro semanas de co-cultura en la AAPC media veces la expansión de células CD3 + células T es 19.800 ± 11.313 con CA R expresión ⁺ ser del 90% ± 7,5 ^13. Estas células T son criopreservados y someterse en proceso y de las pruebas de liberación que informa sobre la seguridad y el potencial terapéutico del producto acabado. Las pruebas de lanzamiento se lleva a cabo de acuerdo con las modificaciones de laboratorio clínico mejora (CLIA) para generar un certificado de análisis antes de la infusión en los destinatarios de los ensayos clínicos.

Figura 1. Pasos que describen el proceso de electroporación y propagar CAR + células T de PB y UCB. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Figura 2. Caracterización de cultivos modificados genéticamente las células T de PB. (A) Expresión de EGFP en el Día 0 de primer ciclo de estimulación para evaluar la eficacia de la transferencia génica. Expresión de CD19 específico de CAR (CD19RCD28) como se evaluó por citometría de flujo en células CD3 ^+, CD8 ⁺ y CD4 ⁺ células T en (B) aproximadamente 24 horas después de la electroporación y (C) 28 días después de co-cultivo en AAPC. Similar expresión de CAR se observó con células T derivadas de UCB. (D) Cinética de expresión de CAR. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3. Propagación de PB derivados CAR+ T células. Tasa de expansión numérico de CD3 ⁺ y CAR ⁺ células T derivadas de PB por repitió el co-cultivo de γ-irradiado en presencia de AAPC soluble recombinante humano IL-2 e IL-21-. Flechas hacia arriba indican las adiciones de γ-irradiado AAPC que marcan el comienzo de cada ciclo de estimulación. UCB-derivados de turismos ⁺ células T presentan tasas similares de expansión numérica.

Figura 4. Esquema del proceso de fabricación utilizando SB y sistemas de AAPC para modificar genéticamente y propagar CAR ⁺ células T derivadas de PB y UCB. CD19 específico de coche ⁺ células T se generaron mediante electro-transferencia de SB-derivados plásmidos de ADN superenrollado y posteriores de co-cultivo en K562 derivado de AAPC (clon n º 4) en presencia of IL-2 recombinante humana soluble e IL-21. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Fuente de células T	Transposón *	Transposasa	Infusión de las células T	IRB #	NIH-OBA #	IND #
Autóloga (paciente derivado) **	CD19RCD28	SB11	Después autólogo de células madre hematopoyéticas trasplante	2007-0635	0804-922	14193
Alogénico (donante-derivado)	CD19RCD28	SB11	Después alogénico de células madre hematopoyéticas trasplante	2009-0525	0910-1003	14577
Alogénico (donante-derivado)	CD19RCD28	SB11	Después del trasplante alogénico de sangre de cordón umbilical	2010-0835	1001-1022	14739

* Tabla 1. Los ensayos clínicos bajo los auspicios de la FDA en MDACC para infundir CD19 específico CAR ⁺ células T propagada en AAPC. Las células T son prestados específico para CD19 a través de la expresión forzada de transposón SB codificación para un coche de 2 ^ª generación, CD19RCD28 designado, que las señales a través de CD28 y CD3 ε. ** Prueba descrito en la referencia ^5.

Discusión

Transposón y sistemas de transposasa, tales como de piggyBac ^12,19 y SB ^18,20-22, son no virales enfoques de terapia génica que son una alternativa a viral mediada por la transducción de grado clínico CAR ⁺ células T. El SB fue elegido como el sistema de transferencia génica basado en su potencial para la terapia génica humana ^1,6,23. Hemos desarrollado las tecnologías duales de transposición SB (para introducir un coche) y la adición recursiva de γ-irradiado AAPC (para recuperar células T modificadas genéticamente que expresan establemente un CAR) para servir como tecnologías de la plataforma en la fabricación de células T específicas de TAA en cumplimiento con cGMP para la Fase I / II de ensayos (Figura 4). Después de 28 días (cuatro días-7 ciclos de estimulación) de co-cultivo sobre γ-irradiado AAPC, que generalmente son capaces de generar por lo menos ~ ¹⁰ 10 modificados genéticamente las células T adecuadas para aplicaciones en seres humanos. Según sea necesario, ciclos adicionales de estimulación pueden ser emprendido to generar un mayor número de células T modificadas genéticamente. Además, si menos CAR ⁺ células T son necesarios, el enfoque de la electroporación y la propagación puede ser reducido empleando un menor número de cubetas y llevar adelante sólo una sub-conjunto de las células T expandidas numéricamente para las siguientes rondas de proliferación en AAPC al comienzo de cada Estimulación ciclo. La mayoría de la electroporación y se propagan las células T recolectadas para perfusión expresan de manera estable el CAR. La extensión de las células CD4 ⁺ y CD8 ⁺ células T que expresan nuestra 2 ^ª generación CAR incluyen las células con un fenotipo de memoria / ingenua y presentan tres características de la re-dirigido especificidad. En primer lugar, las células genéticamente modificadas T específicamente lisar objetivos CD19 ^+, en segundo lugar, producir IFN-γ en respuesta a células estimuladoras CD19 ⁺ y en tercer lugar, proliferan en respuesta a CD19 ⁺ células alimentadoras, todas en una manera dependiente del automóvil ^13,18. Nuestro enfoque integrcomió un transgén CAR por electro-transferencia de plásmidos de ADN no virales del sistema SB puede llevarse a cabo en las células T quiescentes primarios derivados de PB y UCB. Nosotros y otros han modificado genéticamente células K562 para servir como AAPC para propagar eficazmente números clínicamente suficiente de células T para la infusión ^24,25. La AAPC y el medio ambiente de cultivo de tejidos (por ejemplo, la adición de IL-21) se han se han modificado para generar el paciente y el donante derivado de CD19 de células T específicas para perfusión después de células madre hematopoyéticas trasplante (Tabla 1) ^13,18. Podemos producir CAR + células T de PB simplemente obtenida por punción venosa que evita el coste, el malestar y molestias de obtener MNC de PB por aféresis. La posibilidad de obtener un gran número de CAR ⁺ células T de un pequeño número de empresas multinacionales es especialmente atractivo para la infusión de las células T después de trasplante alogénico trasplante UCB. El pequeño tamaño y el anonimato del donante neonatal se opone a re-Acceder a este individuo en un punto de tiempo más tarde y sólo un número limitado de cosechada MNC están disponibles como material de partida para la fabricación de células T para evitar la interferencia con la hematopoyesis. Otros avances en el proceso de fabricación en curso para incluir un dispositivo de electroporación de alto rendimiento junto con un biorreactor WAVE completamente cerrada para minimizar la manipulación. En total, el SB y AAPC son atractivas plataformas para generar CD19 específico de CAR ⁺ células T que pueden ser adaptados para generar grandes números de células T modificadas genéticamente que pueden reconocer alternativas de la superficie celular TAA en el cumplimiento de cGMP.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos	Vendedor	Número de catálogo
			Reactivos
ADN de plásmido que expresa GFP (pmaxGFP)	Lonza	VPA-1002 (kit)
PBS	Sigma	D8537
CliniMACS PBS-EDTA	Miltenyi Biotec	70026
HyQ RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30096.01
Fenol libre RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30605.01
Hyclone suero fetal bovino	Thermo Scientific	SH3007003HI
GlutaMAX(100x)	Gibco	3505-061
Ficoll-Paque	GE Healthcare Biosciences	17-1440-02
IL-21 recombinante humana	PeproTech	AF-200-21
IL-2 humana recombinante (Proleukin)	Novartis	NDC 65483-116-07
Human T Kit celular (Solución Nucleofector)	Lonza	VPA-1002
CliniMACS CD56 reactivo	Miltenyi	70206
FITC-conjugado con mAb de ratón específico para CD3 humano	BD Biosciences	349201
APC-ratón conjugado con mAb específico para CD4 humanos	BD Biosciences	340443
PerCPCy5.5-conjugadopara ratón mAb específico para CD8 humana	BD Biosciences	341051
PE-conjugado con F (ab ') 2 fragmento de anticuerpo de cabra específico para Fc gamma humana	Invitrogen	H10104
Sodio azida	Sigma	S2002
			Desechables
12-así placa	Corning	3513
T-75 cm 2 frasco	Corning	430641
Bolsas de cultivo	Vue Vida	290C, 750C
50 ml tubo de centrífuga	BD Biosciences	352098
			Equipos
Amaxa Nuceleofector II	Lonza	AAB-1001
Cellometer	Bioscience Nexcelom	Visión Cellometer
Centrífuga Sorvall Legend RT	Sorvall	75004377
BD FACS Calibur	BD Biosciences	342975
Congelador de velocidad controlada	Planer	Kryo 750
Irradiador	CIS bio international	IBL-437 C # 09433
			NombreComún La expresión de moléculas (endógena e introducidos) Línea celular Tipo de célula Moléculas expresadas CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Clon 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expresada con membrana unida IL-15 < td> Medios completos Cultura (CCM) (almacenado a 4 º C durante hasta 30 días) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 FBS 10% 1% GlutaMAX Citometría de flujo de tampón (almacenado a 4 º C durante hasta 30 días) PBS FBS 2% 0,1% de azida de sodio