La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

Sharanya Iyengar; Yariv Houvras; Craig J. Ceol

doi:10.3791/50086

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La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

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DOI:

10.3791/50086

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13 de noviembre de 2012

Sharanya Iyengar¹ , Yariv Houvras²^,³ , Craig J. Ceol¹

¹Program in Molecular Medicine and Department of Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School, ²Departments of Surgery and Medicine, Weill Cornell Medical College , ³Departments of Surgery and Medicine, New York Presbyterian Hospital

En este artículo

Resumen

Una forma rápida de pantalla para los modificadores de melanoma utilizando un modelo de pez cebra tumor autóctona se presenta. Se aprovecha de la miniCoopR vector que permite la expresión de los genes candidatos de melanoma en los melanocitos. Un método para obtener gratis melanoma curvas de supervivencia, un ensayo de invasión, un protocolo para la tinción de anticuerpos de los melanocitos de escala y un ensayo de trasplante de melanoma se describen.

Resumen

Los estudios genómicos de cáncer en humanos han arrojado una gran cantidad de información acerca de los genes que están alterados en los tumores ^1,2,3. Un desafío que surge de estos estudios es que muchos genes están alterados, y puede ser difícil distinguir las alteraciones genéticas que impulsaron la tumorigénesis de aquellos que surgió incidentalmente durante la transformación. Para hacer esta distinción es beneficioso tener un ensayo que puede medir cuantitativamente el efecto de un gen alterado en la iniciación del tumor y otros procesos que permiten a los tumores a persistir y difundir. Aquí presentamos un medio rápido para detectar un gran número de candidatos modificadores de melanoma en el pez cebra utilizando un modelo de tumor ⁴ autóctona que abarca los pasos necesarios para la iniciación y el mantenimiento de melanoma. Un reactivo clave en este ensayo es el vector miniCoopR, que acopla una copia de tipo salvaje del factor de especificación mitfa melanocitos a un casete de recombinación Gateway en el que candidato melAnoma genes pueden ser recombinados ^5. El vector miniCoopR tiene un minigen rescate mitfa que contiene el promotor, marco de lectura abierta y la región 3 'no traducida del gen de tipo salvaje mitfa. Nos permite hacer construcciones con larga duración marcos de lectura abierta de modificadores de melanoma candidatos. Estos clones individuales pueden ser inyectados en célula única Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra. El vector miniCoopR se integra por Tol2 transgénesis mediada ⁶ y rescata a los melanocitos. Debido a que están físicamente acoplado a la minigen mitfa rescate, genes candidatos se expresa en los melanocitos rescatadas, algunas de las cuales se transforman y se desarrollan en tumores. El efecto de un gen candidato en la iniciación melanoma y propiedades celulares de melanoma se puede medir usando libres melanoma curvas de supervivencia, los ensayos de invasión, tinción de anticuerpos y ensayos de trasplante.

Protocolo

1. La detección de Onset Modificadores Melanoma

Cree clones de entrada de puerta de enlace media por PCR amplificando el marco de cuerpo entero de lectura abierta de los genes de interés (GOI) y recombinación en pDONR 221 con BP Clonase II (Invitrogen). Use Multisite tecnología de Gateway (Invitrogen) para recombinarse p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA ⁶ y miniCoopR ⁵ para colocar los genes de interés bajo el promotor en el vector mitfa miniCoopR (Figura 1A).
Inyectar 25 picogramos de cada clon junto con 25 picogramos Tol2 transposasa mRNA en una célula Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra triplemente homocigotos como se ha descrito previamente ^7. Se incuban los embriones inyectados a 28,5 ° C. Retire los embriones muertos a las 24 HPF.
Seleccione los animales transgénicos con melanocitos rescatados a 72 HPF, colocando la placa de Petri que contiene los embriones inyectados en una disección microscópicase con luz incidente sobre un fondo blanco (fig. 1A).
Transfiera los animales a 3 tanques de L en el vivero de la instalación de pez cebra a 4 dpf a lo descrito previamente ^8.
A los 2 meses, seleccionar los animales con al menos un área de rescate melanocitos mayor que 4 mm ² (Figura 1A). Hay una fuerte correlación entre el grado de rescate de melanocitos en 72 HPF y el grado de rescate de melanocitos a los 2 meses. Cuando los embriones con rescate de los melanocitos se recogió en 72 hpf, la mayoría de ellos (~ 80%) tendrá al menos un área de rescate melanocitos mayor que 4 mm ² a los 2 meses.
Pantalla de los animales seleccionados semanales para detectar la presencia de tumores (Figura 1B). Hay una fuerte correlación entre los cambios histopatológicos y morfológicas. Transición de benigno a maligno se reconoce como un cambio morfológico cuando las lesiones se elevó fuera de la superficie del animal. Aislar anima con el tumorls de estudio.
Dibujar libres melanoma curvas de supervivencia con la edad en semanas en las abscisas y el porcentaje de supervivencia libre de melanoma en la ordenada. Los animales con los melanocitos que expresan un gen de interés se comparan con los animales control que expresa EGFP (proteína verde fluorescente) en los melanocitos (Figura 1C). La aparición de tumores mediana para los animales inyectados con miniCoopR-EGFP es de aproximadamente 18 semanas. Determinar si las dos curvas son diferentes estadísticamente mediante la prueba de log-rank.

2. Ensayo de invasión tumoral

Seleccione pez cebra aislado que desarrollan tumores dorsalmente, en una región entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal (Figura 2A).
Dos semanas después de la aparición del melanoma eutanasia a los peces según las directrices especificadas por la American Veterinary Medical Association Panel sobre la eutanasia y aprobado por la Universidad de Massachusetts Medical School InsCuidado de Animales y el empleo Comisión titucional (IACUC). Específicamente, un pez se coloca en un plato con 0,6 mg / ml hasta tricaína movimiento branquial se detiene.
Hacer una incisión en la cavidad peritoneal de los peces con un escalpelo y luego coloque el pescado en 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 ° C para su fijación.
Tratar con 0,5 M EDTA durante la noche a 4 ° C para descalcificar.
Fijar con formalina en casete durante la noche, se deshidratan durante 1 hora, claro con xileno 3 veces durante 1 hora y luego se trata con parafina 2 veces durante 2 horas cada una a 60 ° C.
Insertar el tejido en parafina en un molde y dejar que se solidifique durante 30 min a 1 hr.
Hacer 5 micras secciones, una cada 50 micras. Las secciones deben ser transversal y a través de toda la lesión para que el punto más profundo de invasión puede ser identificado. Siga con hematoxilina y eosina.
Evaluar la invasión tumoral midiendo si las células tumorales permanecen fuera de la colágena compactum estrato, invadir la dorsalmusculatura o invadir adicional en la columna vertebral (Figura 2B, C). Determinar la diferencia estadística entre los dos grupos de muestras.

3. Antibody tinción de melanocitos Escala

Maquillaje PO4 tampón con 80 ml de 0,1 M Na ₂ HPO ₄ y 20 ml de 0,1 M NaH ₂ PO _4. Asegúrese de que el pH es de 7,3. Maquillaje solución tampón 2x que contiene 8,0 g de sacarosa, 0,15 ml 0,2 M CaCl ₂ y 90 ml de 0,2 M tampón de PO _4, pH 7,3. Si es necesario ajustar el pH a 7,3 con NaOH o HCl completar hasta 100 ml con tampón de PO _4.
A pesar hasta 300 mg PFA sólido y añade a un tubo de microcentrífuga. Añadir 5 mM NaOH a un volumen igual a la masa x 4,5, en mg, de PFA (por ejemplo, 450 ul 5 mM NaOH a 100 mg PFA). Se calienta a 60-70 ° C con agitación ocasional hasta que el PFA se disuelve. Decantar las partículas restantes y recuperar el 20% PFA sobrenadante. Haga fresca cada vez.
Preparar la solución de fijación que contiene 1x fix tampón y 4% PFA.
Se anestesia el pescado en 0,17 mg / ml tricaína.
Usando la luz incidente bajo un microscopio de disección arrancar escamas dorsales agudas utilizando pinzas de punta fina, teniendo cuidado de no dañar el medio que contiene los melanocitos de la escala (Figura 3A). Escalas lugar directamente desde las pinzas en 1 ml de solución de fijación y se incuba a temperatura ambiente, mientras se gira, por ≥ 2 hr. Transferir el pez en el agua los peces y controlar a los peces a confirmar una recuperación exitosa.
Para blanquear melanocitos pigmentados lavar escalas fijas en PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 veces durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 1 ml de lejía recién preparada que contiene 0,4 ml de solución de KOH al 10% y 0,15 ml de 30% de H ₂ O ₂ en 5 ml de dH ₂ O. Ponga cerraduras Parafilm o gorra para evitar que el gas se rompa los tubos abiertos. Continuar hasta decoloración de pigmento se ha ido (10 min es típico) (Figura 3B, C). Lavar cuatro veces en PBST durante 5 min a temperatura ambientetura.
Bloquear por lo menos durante 30 minutos en solución de bloqueo compuesta por 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml de BSA, 1% de DMSO, 0,02% NaN ₃ y 2% suero de cordero. Dejar de lado NaN _3, si el desarrollo de la reacción con HRP.
Incubar con anticuerpo primario en solución de bloqueo durante la noche a temperatura ambiente. Debe tener al menos 400 l de solución sobre las muestras para mantenerlas sumergidas.
Lavar las escalas 3 veces durante 30 minutos en PBST a temperatura ambiente.
Incubar con anticuerpo secundario de 2 horas a toda la noche en solución de bloqueo a temperatura ambiente.
Teñir durante 10 min con PBST DAPI mu M + 0,1.
Lavar 3 veces durante 5 min con PBST.
Montar la balanza sobre un portaobjetos de vidrio en una gota de Vectashield de modo que el lado cóncavo de la balanza está orientado hacia abajo hacia el portaobjetos y colocar un cubreobjetos de cristal sobre ellos. Selle los bordes de la diapositiva con esmalte de uñas transparente y observar las diapositivas con un microscopio de fluorescencia (Figura 3 D, E, F, G ).

4. Trasplante de Ensayo

Preparar destinatario 2-3 meses de edad casper ⁹ peces por irradiación con 25 Gy de irradiación gamma, un día antes del trasplante ^10. Permitir a los peces a recuperarse en el agua los peces.
Eutanasia a un pez portador del tumor como se ha descrito anteriormente (Sección 2,2).
Corte el tumor y lo puso en una caja de Petri con filtro de aproximadamente 5 ml de PBS esterilizado 0.9x con FBS al 5%. Cortar el tumor con una maquinilla de afeitar mientras está en solución.
Trabajando a temperatura ambiente, se tritura con una pipeta P1000 para obtener células individuales. Completar el volumen a 25 ml con PBS esterilizado por filtración 0.9x con FBS al 5%.
Filtrar a través de filtro de 40 de malla.
Haga girar en una centrífuga de mesa Eppendorf 5810R a 1.500 rpm (453 fcr) durante 10 min.
Eliminar el sobrenadante y crea suspensión de células a la concentración de aproximadamente deseado (suponga 10 ⁷ células para un 100 mm ³ tumor).
Calcular tque el número de células exacta usando un hemocitómetro y se diluye la suspensión de células de modo que el volumen de inyección final es de aproximadamente 5 l. Por ejemplo, si las células son 50.000 a inyectar, la suspensión celular se diluyó a una concentración final de 10.000 células / mL. Flick el tubo que contiene la suspensión de células cada pocos minutos para evitar la aglutinación de las células.
Lave un calibre 26s (punta biselada) jeringa l 701 N 10 Hamilton 2-3 veces con etanol al 100% y PBS 0.9x. Cargar la jeringa con 5 l de la suspensión celular.
Se anestesia el pez receptor irradiado en 0,17 mg / ml tricaína. Coloque el pescado en su lado en una Kimwipe húmedo (Figura 4A).
Estabilizar el pescado con una mano e inserte la aguja con el bisel hacia arriba en un ángulo de 45 ° en el flanco del pez encima de la cavidad peritoneal a medio camino entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal. Suavemente el émbolo (Figura 4B).
Permiten a los peces recuperar en peces de agua dulce y observar los peces diaria para el injerto del tumor (Figura 4C). Si el injerto se ha producido, el continuo crecimiento y desarrollo de la enfermedad también puede ser observado.